新贵exosome

2021-03-23 e药安全

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新贵exosome

Exosome是肿瘤研究的新贵，原因在于它既可以往生物标志物方向发展，也可以往机制研究方向发展——尤其是它能够出人意表地实现生物信息从一类细胞到另一类细胞的“穿梭”，让我们再次感受到生命的神奇。

对于Exosome，主要是因为游离microRNA。在临床应用上它的提取技术不够成熟，不够稳定；对于基础研究，过于昂贵。

exosome作为生物标志物，有着ctDNA不可比拟的优势。打个不恰当的比方，如果我们把面对的一个个肿瘤，看成是一个个穷凶极恶的杀人犯，exosome 就是这些凶手用的凶器——这一点类似CTC，它们都是承载着生物学功能的功能单元，而ctDNA，更像是足迹，指纹，它们可用来追踪凶手的信息。但是我们都知道，一个凶手能够留下的足迹，指纹多少，是不一定的——甚至可能会隐藏所有的痕迹，但是再狡猾的凶手都必须使用凶器。所以，如果exosome和CTC的技术能够成熟到一定程度，他们作为生物标志物的优势，是不言而喻的。

但是，至少exosome和CTC发展了这么多年，技术的进步离领域的期望，还是有不小的差距。在下面这篇文章中竟然在exosome中能够检测到整个肿瘤的基因组信息——没错，不是片段，是整个基因组。

我们永远都觉得WGS在反映肿瘤大片段，结构性基因变异信息上，有着不可替代的优越性。这些信息对于我们完整地了解肿瘤，是非常重要的。由于技术上的局限性，这种重要性远远没有引起领域内足够的正视。在ctDNA中要检测出全基因组信息，这一直是件很有挑战性的事情。但是exosome的出现，是否能够提供让这个挑战变得并不是那么触不可及呢。

下面是这篇文章的主要内容：

【研究摘要】

本文主要是分析了源自K-562（慢性髓系白血病），HCT-116（结直肠癌），B16-F10（黑色素瘤）等细胞系的exosome中的DNA性质。研究者分别用酶学和原子力显微镜（AFM）的方法确认了在exosome囊泡膜内和膜表面都有dsDNA。通过对比很多细胞系（包括永生化的成纤维细胞细胞系）分泌的exosome DNA （exoDNA）含量，研究者发现肿瘤细胞系整体上分泌的exoDNA总量要高于正常细胞。但是在不同来源的肿瘤细胞系中， exoDNA也是差别很显著的。他们随后用B16-F10作为模型，通过全基因组测序和比较基因组杂交，研究者发现exoDNA中完整、无偏差地包含了肿瘤细胞全基因组信息。随后研究者又在细胞系中验证了检测exoDNA中和EGFR相关的actionable mutaion的可行性，并进一步拓展到动物移植瘤模型中收集的外周血检测。整体研究证实了在exosome中存在着大量的dsDNA，并进一步揭示了exoDNA在临床检测作为生物标志物的应用潜力。

【研究数据解析】

研究者首先通过酶学的方法，利用S1核酸酶（仅消化ssDNA）和Shrimp核酸酶（仅消化dsDNA）分别处理提取的exoDNA，可以发现exosome中大部分的都是dsDNA，也存在一部分的ssDNA（K-562，a标示的处理组）。随后用这两种酶处理完整的exosome，然后再提取exoDNA——这一步可以去除膜表面的DNA。综合（K-562，b标示的处理组，用S1核酸酶预处理；c标示的处理组用Shrimp核酸酶预处理；B，C，分别是HCT116，B16-F10的exosome接受核酸酶处理）多个细胞系的结果，在exosome的膜表面存在着一定数量的DNA，且大多是分子量>2.5 kb的dsDNA。相应地，exosome囊泡内的DNA大多是小片段dsDNA（200bp-1kb）。

研究者进一步用原子力显微镜证实了exoDNA的性质更接近dsDNA。

研究者随后对多个细胞系分泌的exoDNA进行了分析，根据结果显示肿瘤细胞系整体上分泌的exoDNA总量要高于正常细胞（成纤维细胞DF，O97）。但是在不同来源的肿瘤细胞系中， exoDNA也是差别很显著的。通过酶学方法，进一步证实大部分肿瘤细胞的exoDNA仍为dsDNA（大部分>50%)。

研究者以B16-F10为模式细胞，用1ug exoDNA来进行全基因组测序，获得了与B16-F10完全相同的基因组DNA图谱。研究者通过分析测序数据和比较基因组杂交结果，发现exoDNA相比基因组DNA，其组成上并没有编码区或非编码区，正义链或反义链，特定的基因组区段的富集或缺失的偏向性。甚至exoDNA的甲基化水平（5’-cytosine）都与基因组DNA类似。

随后，作者分别在肿瘤细胞培养分泌的exoDNA和荷瘤小鼠外周血提取的exoDNA成功检测到了actionablemutation，如BRAF（V600E）。

【综合点评】

这篇文章虽然非常短小，而且主要是依赖于肿瘤细胞系的exoDNA检测，但是仍然用非常全面的实验学方法，证实了exoDNA的一些性质——这些都是非常有参考价值的。

几点建议：

1. ctDNA 和 exoDNA 是否有交集？

要说明这个问题，特意看了一下文章补充材料中研究者采用的exoDNA提取方法。作者在这里采取的是超速离心方法。这个方法严格意义上提取的是extracellularvesicle （EV）。尽管exosome是EV中重要组成部分，但EV中还有很多其他类型的囊泡，例如凋亡小体——而ctDNA被认为最重要的一个来源就是来源于凋亡细胞，是有可能包裹在凋亡小体中的。因此，通过超速离心方法获得的exosome，可能有相当一部分凋亡小体的污染。相应地，这样获得的exoDNA可能与ctDNA有一部分交集。得率高，但有其他囊泡污染，也是用超速离心法研究exosome最大的问题之一。

本文中有些证据也提示这种可能，一个是酶学分析exoDNA组成实验中，数据表明囊泡内的exoDNA主要集中在小片段（200bp-1kb）。特别是在B16-F10中，片段比较明显的集中在200bp左右，这个与ctDNA的大小是非常接近的。因此，是否有可能真正的exoDNA都是大片段（>2.5kb）且整合在exosome表面。文中看到的囊泡内的exoDNA，其实大部分是来源于凋亡小体的ctDNA。另一个证据是，在补充材料中研究者用抗dsDNA的抗体对exosome进行免疫电镜，发现只有10%的exosome是阳性——在电镜下是能够很清楚的分辨凋亡小体和exosome。这可能也部分提示，酶学研究发现的大部分dsDNA都可能是来源于凋亡小体。

2. Exosome DNA更适合用测定肿瘤基因组特征

ctDNA作为肿瘤DNA遗传特征分析最核心的问题之一，就是到底多少量的ctDNA，才基本上能够覆盖全基因组。这个问题一方面跟采用的检测方法的灵敏度相关，另一方面也跟ctDNA客观上在单位体积血液中拷贝数有关。

我们可以做一个粗略的估算：

假设1：

产生ctDNA的凋亡肿瘤细胞数目总数，平均到每毫升血液有1个细胞（这个估算应该还是比较保守的，综合现有的CTC检出率和已知的肿瘤细胞在外周血中死亡率）。每个细胞的基因组DNA（ctDNA）的量是7pg。

假设2：

ctDNA在cfDNA中的比例为0.1%（这个数据也是比较保守的，根据现有的ctDNA研究数据看）。

因此，在这种最保守的情况下是7ng，加上点火耗，就算10ng——这和之前别的文献测定的结果是类似的【Nature medicine2014, 20(5): 548-554.】。换句话说，在不考虑检测灵敏度的情况下，实际上10ng的cfDNA就实现了“一滴血一个世界”。如果我们要考虑到反映肿瘤细胞异质性，1个ug的cfDNA就可以代表100个肿瘤细胞。

在本文中，研究者用了1ug的exoDNA拼出癌症细胞的全基因组DNA。考虑到培养的细胞并没有来源于正常细胞的cfDNA稀释，研究者的这个实验结果本身，并不足以让人惊讶。

但是，我们应该注意到的一个事实是，正常细胞（成纤维细胞）分泌的exosome中dsDNA含量很低（请注意并不是正常细胞分泌的exosome很少，而是分泌的exosome中dsDNA含量很低），而肿瘤细胞分泌的exosome中却大量地把肿瘤基因组DNA包裹进来。因此，肿瘤来源的exosome，实质上成为了一个富集肿瘤DNA的载体。

要知道，cfDNA对ctDNA的稀释，是测定ctDNA基因变异最大的阻碍——尤其是对于一些同时患有慢性炎症的肿瘤患者，可以想象炎症反应也会导致大量的cfDNA释放。如果这篇文章描述的以下两点都是可被重复证实的：其一，肿瘤细胞分泌的exosome中包含了大量的来源于肿瘤细胞的基因组DNA片段；其二，正常细胞分泌的exosome中DNA含量很低。那么分析exoDNA，的确是一种很有优势的肿瘤遗传信息的方法。