ctDNA技术FAQ

ctDNA技术FAQ

Q1：ctDNA分离用血浆，还是血清更合适？

A：有大量研究数据表明，血清中的cfDNA含量要显著性高于（3-24倍）血浆中含量。这主要是由于血清制备中，凝血过程可能会造成微量的溶血，因此会有一定的血细胞核酸污染。但是目前并没有较充分的证据证实，ctDNA含量在血清和血浆中是否也是存在这种不均衡性。

Q2：抽提ctDNA所需的血浆/血清制备，有什么特别需要注意的地方？

A：抽提ctDNA所需的血浆/血清制备过程，和常规血清/血浆制备有一些不同和需特别注意之处：

血清/血浆通常需要经过“两步离心法”制备，第一步离心采用常规的血清/血浆制备离心速度，第二步需要采用高转速（14000-16000g），用于去除血浆/血清中可能残留的细胞碎片和一些破碎细胞释放的基因组DNA。

血浆/血清制备过程尽可能避免溶血，例如减少抽血到血浆/血清制备的时间，离心转速严格控制等。因为破碎的血细胞释放的基因组DNA可能会大大稀释较微量的cfDNA，影响后面检测的准确性。

Q3：抽提的ctDNA如何质控和定量？

A： ctDNA的片段分布可以通过Agilent2000（2100）来确定。

在ctDNA极其低的情况下，它的定量测定极易受到少量单链核酸，蛋白质和RNA的污染，因此对于采用紫外吸光法的定量策略，例如NanoDrop，可能并不适合。相对来说，Qubit较多地用于cfDNA的定量（Qubit®dsDNA HS assay）。

Q4：分析ctDNA的突变有哪些方法？

A：分析ctDNA的突变特征方法，根据我们关注的突变类型不同，选用的方法也有所差异：

待检测的是已知的点突变，较常见的方法有BEAMing，Digitaldroplet PCR等；

待检测的是单个或多个基因突变，较常见的方法有SafeSeqs，TAM-Seq；

待检测的是基因组染色体拷贝数变异（CNV），有Digitalkaryotyping；

待检测的是基因组染色体重排，有PARE。

Q5：目前分析ctDNA最敏感的方法是那种？

A：对ctDNA分析的灵敏度也取决于关注的ctDNA突变特征，对于染色质重组这类特征，有研究表明灵敏度可达到0.002%（突变型：野生型约为1：50000）（Sci TranslMed. 2010 Feb 24;2(20):20ra14. doi: 10.1126/scitranslmed.3000702.）而对点突变检测的一系列方法，最常见的有BEAMing，digitaldroplet PCR等，灵敏度可达0.005-0.01%。而靶向多基因的NGS测序技术，检测灵敏度约为0.1-0.01%。

Q6：目前有没有特殊的方法可以在cfDNA中富集ctDNA？

A：目前由于我们对于ctDNA的性质，除了对其携带突变这一特征比较明确外，其他物化性质了解得较有限。但是由大量研究提示ctDNA大多集中在150-200bp这个大小的片段中。因此，理论上可以对这部分大小的核酸片段进行分级分离（Sizefractionation），以实现对ctDNA的富集。现已有相关试剂盒商业化“TheEpiQuik™ Circulating Cell-Free DNA Isolation Kit”，但其抽提的依然是cfDNA。