瑞芬太尼对缺氧/复氧诱导的PC12细胞损伤的作用

                                                                 【论著】

本研究旨在研究瑞芬太尼对脑缺血/再灌注损伤的保护作用是否与蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/信号转导和转录激活因子3（Akt/mTOR/STAT3）信号通路有关，为缺血/再灌注神经元损伤修复提供了新的治疗方法及治疗靶点。

将PC12细胞按照随机数字表法分为缺氧/复氧组（缺氧15 h后复氧5 h），空白组（正常培养的细胞），瑞芬太尼低、中、高浓度组（2、10、50 mg/L瑞芬太尼处理缺氧/复氧诱导的PC12细胞），瑞芬太尼+LY294002组（10 mg/L的瑞芬太尼和50 μmol/L的LY294002处理缺氧/复氧诱导的PC12细胞），瑞芬太尼+PBS组（10 mg/L的瑞芬太尼和等量的磷酸盐缓冲液处理缺氧/复氧诱导的PC12细胞）（每组9孔）。Western blot法检测各组细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶‑3（cleaved caspase‑3）、B淋巴细胞瘤‑2相关X蛋白（Bax）、B淋巴细胞瘤‑2（Bcl‑2）、磷酸化蛋白激酶B（p‑Akt）、磷酸化雷帕霉素靶蛋白（p‑mTOR）和磷酸化信号转导和转录激活因子3（p‑STAT3）蛋白水平；四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测细胞存活率，流式细胞术检测细胞凋亡；活性氧（ROS）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒分别检测空白组、缺氧/复氧组和瑞芬太尼低、中、高浓度组ROS水平和SOD活性；ELISA法检测各组IL‑1β和TNF‑α水平。

2.1　5组PC12细胞中Cyclin D1表达水平和细胞存活率比较

与空白组比较，缺氧/复氧组PC12细胞中Cyclin D1表达水平和细胞存活率明显降低（P<0.05）；与缺氧/复氧组比较，瑞芬太尼低、中、高浓度组PC12细胞中Cyclin D1表达水平和细胞存活率明显升高（P<0.05）。见图1、表1。

2.2　5组PC12细胞中cleaved caspase‑3、Bax、Bcl‑2蛋白水平和细胞凋亡率比较

与空白组比较，缺氧/复氧组PC12细胞中cleaved caspase‑3、Bax蛋白水平和细胞凋亡率明显升高，Bcl‑2蛋白水平明显降低（P<0.05）；与缺氧复氧组比较，瑞芬太尼低、中、高浓度组PC12细胞中cleaved caspase‑3、Bax蛋白水平和细胞凋亡率明显降低，Bcl‑2蛋白水平明显升高（P<0.05）。见图2、表2。

2.3　5组PC12细胞中ROS荧光强度和SOD活性比较

与空白组比较，缺氧/复氧组PC12细胞中ROS荧光强度明显升高，SOD活性明显降低（P<0.05）；与缺氧/复氧组比较，瑞芬太尼低、中、高浓度组PC12细胞中ROS荧光强度明显降低，SOD活性明显升高（P<0.05）。见表3。

2.4　5组PC12细胞培养上清液中炎症因子IL‑1β、TNF‑α水平比较

与空白组比较，缺氧/复氧组PC12细胞中IL‑1β和TNF‑α水平明显升高（P<0.05）；与缺氧/复氧组比较，瑞芬太尼低、中、高浓度组PC12细胞中IL‑1β和TNF‑α水平均明显降低（P<0.05）。见表4。

2.5　5组PC12细胞中p‑Akt、p‑mTOR和p‑STAT3蛋白水平比较

与空白组比较，缺氧/复氧组PC12细胞中p‑Akt、p‑mTOR和p‑STAT3蛋白水平明显降低（P<0.05）；与缺氧/复氧组比较，瑞芬太尼低、中、高浓度组PC12细胞中p‑Akt、p‑mTOR和p‑STAT3蛋白水平均明显升高（P<0.05）。见图3、表5。

2.6　4组PC12细胞中CyclinD1、cleaved caspase‑3、Bax、p‑Akt、p‑mTOR、p‑STAT3、IL‑1β、TNF‑α、细胞存活率、细胞凋亡率比较

与空白组比较：缺氧/复氧组PC12细胞中cleaved caspase‑3、Bax、IL‑1β、TNF‑α、细胞凋亡率明显升高，Cyclin D1、Bcl‑2、p‑Akt、p‑mTOR、p‑STAT3及细胞存活率明显降低（P<0.05）。与瑞芬太尼+PBS组比较：瑞芬太尼+LY294002组PC12细胞中cleaved caspase‑3、Bax、IL‑1β、TNF‑α及细胞凋亡率明显升高，Bcl‑2、p‑Akt、p‑mTOR、p‑STAT3及细胞存活率明显降低（P<0.05）。见图4、表6。

本研究结果显示，瑞芬太尼低、中、高浓度组缺氧/复氧PC12细胞中IL‑1β和TNF‑α水平明显降低，ROS荧光强度明显降低，SOD活性明显升高。说明瑞芬太尼可抑制缺氧/复氧诱导的PC12细胞炎性因子释放和氧化应激。

本研究结果显示，瑞芬太尼低、中、高浓度组缺氧/复氧诱导的PC12细胞中Cyclin D1表达水平明显升高，细胞存活率明显升高，cleaved caspase‑3、Bax表达水平明显降低，Bcl‑2表达水平明显升高，细胞凋亡率明显降低，表明瑞芬太尼可能通过调控增殖、凋亡相关蛋白的表达促进细胞存活，抑制缺氧/复氧诱导的PC12细胞凋亡，从而发挥保护PC12细胞损伤的作用。

本研究结果显示，瑞芬太尼低、中、高浓度组缺氧/复氧诱导的PC12细胞中p‑Akt、p‑mTOR和p‑STAT3表达水平明显升高，说明瑞芬太尼可以激活Akt/mTOR/STAT3信号通路。本研究进一步用Akt通路抑制剂LY294002处理瑞芬太尼作用的缺氧/复氧诱导的PC12细胞，结果显示，瑞芬太尼+LY294002组p‑Akt、p‑mTOR和p‑STAT3表达水平明显降低，细胞凋亡率明显升高，细胞存活率明显降低，IL‑1β和TNF‑α水平明显升高，提示瑞芬太尼可能通过调控Akt/mTOR/STAT3信号通路影响缺氧/复氧诱导的PC12细胞存活、凋亡和炎症反应。

综上所述，瑞芬太尼可促进PC12细胞增殖，抑制缺氧/复氧诱导的细胞凋亡、氧化应激和炎症因子的分泌，其机制可能与Akt/mTOR/STAT3信号通路有关。