瑞芬太尼可促进PC12细胞增殖,抑制缺氧/复氧诱导的细胞凋亡、氧化应激和炎症因子的分泌,其机制可能与Akt/mTOR/STAT3信号通路有关。
【论著】
本研究旨在研究瑞芬太尼对脑缺血/再灌注损伤的保护作用是否与蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/信号转导和转录激活因子3(Akt/mTOR/STAT3)信号通路有关,为缺血/再灌注神经元损伤修复提供了新的治疗方法及治疗靶点。
1 材料与方法
将PC12细胞按照随机数字表法分为缺氧/复氧组(缺氧15 h后复氧5 h),空白组(正常培养的细胞),瑞芬太尼低、中、高浓度组(2、10、50 mg/L瑞芬太尼处理缺氧/复氧诱导的PC12细胞),瑞芬太尼+LY294002组(10 mg/L的瑞芬太尼和50 μmol/L的LY294002处理缺氧/复氧诱导的PC12细胞),瑞芬太尼+PBS组(10 mg/L的瑞芬太尼和等量的磷酸盐缓冲液处理缺氧/复氧诱导的PC12细胞)(每组9孔)。Western blot法检测各组细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶‑3(cleaved caspase‑3)、B淋巴细胞瘤‑2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤‑2(Bcl‑2)、磷酸化蛋白激酶B(p‑Akt)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p‑mTOR)和磷酸化信号转导和转录激活因子3(p‑STAT3)蛋白水平;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡;活性氧(ROS)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒分别检测空白组、缺氧/复氧组和瑞芬太尼低、中、高浓度组ROS水平和SOD活性;ELISA法检测各组IL‑1β和TNF‑α水平。
2 结 果
2.1 5组PC12细胞中Cyclin D1表达水平和细胞存活率比较
与空白组比较,缺氧/复氧组PC12细胞中Cyclin D1表达水平和细胞存活率明显降低(P<0.05);与缺氧/复氧组比较,瑞芬太尼低、中、高浓度组PC12细胞中Cyclin D1表达水平和细胞存活率明显升高(P<0.05)。见图1、表1。
2.2 5组PC12细胞中cleaved caspase‑3、Bax、Bcl‑2蛋白水平和细胞凋亡率比较
与空白组比较,缺氧/复氧组PC12细胞中cleaved caspase‑3、Bax蛋白水平和细胞凋亡率明显升高,Bcl‑2蛋白水平明显降低(P<0.05);与缺氧复氧组比较,瑞芬太尼低、中、高浓度组PC12细胞中cleaved caspase‑3、Bax蛋白水平和细胞凋亡率明显降低,Bcl‑2蛋白水平明显升高(P<0.05)。见图2、表2。
2.3 5组PC12细胞中ROS荧光强度和SOD活性比较
与空白组比较,缺氧/复氧组PC12细胞中ROS荧光强度明显升高,SOD活性明显降低(P<0.05);与缺氧/复氧组比较,瑞芬太尼低、中、高浓度组PC12细胞中ROS荧光强度明显降低,SOD活性明显升高(P<0.05)。见表3。
2.4 5组PC12细胞培养上清液中炎症因子IL‑1β、TNF‑α水平比较
与空白组比较,缺氧/复氧组PC12细胞中IL‑1β和TNF‑α水平明显升高(P<0.05);与缺氧/复氧组比较,瑞芬太尼低、中、高浓度组PC12细胞中IL‑1β和TNF‑α水平均明显降低(P<0.05)。见表4。
2.5 5组PC12细胞中p‑Akt、p‑mTOR和p‑STAT3蛋白水平比较
与空白组比较,缺氧/复氧组PC12细胞中p‑Akt、p‑mTOR和p‑STAT3蛋白水平明显降低(P<0.05);与缺氧/复氧组比较,瑞芬太尼低、中、高浓度组PC12细胞中p‑Akt、p‑mTOR和p‑STAT3蛋白水平均明显升高(P<0.05)。见图3、表5。
2.6 4组PC12细胞中CyclinD1、cleaved caspase‑3、Bax、p‑Akt、p‑mTOR、p‑STAT3、IL‑1β、TNF‑α、细胞存活率、细胞凋亡率比较
与空白组比较:缺氧/复氧组PC12细胞中cleaved caspase‑3、Bax、IL‑1β、TNF‑α、细胞凋亡率明显升高,Cyclin D1、Bcl‑2、p‑Akt、p‑mTOR、p‑STAT3及细胞存活率明显降低(P<0.05)。与瑞芬太尼+PBS组比较:瑞芬太尼+LY294002组PC12细胞中cleaved caspase‑3、Bax、IL‑1β、TNF‑α及细胞凋亡率明显升高,Bcl‑2、p‑Akt、p‑mTOR、p‑STAT3及细胞存活率明显降低(P<0.05)。见图4、表6。
3 讨 论
本研究结果显示,瑞芬太尼低、中、高浓度组缺氧/复氧PC12细胞中IL‑1β和TNF‑α水平明显降低,ROS荧光强度明显降低,SOD活性明显升高。说明瑞芬太尼可抑制缺氧/复氧诱导的PC12细胞炎性因子释放和氧化应激。
本研究结果显示,瑞芬太尼低、中、高浓度组缺氧/复氧诱导的PC12细胞中Cyclin D1表达水平明显升高,细胞存活率明显升高,cleaved caspase‑3、Bax表达水平明显降低,Bcl‑2表达水平明显升高,细胞凋亡率明显降低,表明瑞芬太尼可能通过调控增殖、凋亡相关蛋白的表达促进细胞存活,抑制缺氧/复氧诱导的PC12细胞凋亡,从而发挥保护PC12细胞损伤的作用。
本研究结果显示,瑞芬太尼低、中、高浓度组缺氧/复氧诱导的PC12细胞中p‑Akt、p‑mTOR和p‑STAT3表达水平明显升高,说明瑞芬太尼可以激活Akt/mTOR/STAT3信号通路。本研究进一步用Akt通路抑制剂LY294002处理瑞芬太尼作用的缺氧/复氧诱导的PC12细胞,结果显示,瑞芬太尼+LY294002组p‑Akt、p‑mTOR和p‑STAT3表达水平明显降低,细胞凋亡率明显升高,细胞存活率明显降低,IL‑1β和TNF‑α水平明显升高,提示瑞芬太尼可能通过调控Akt/mTOR/STAT3信号通路影响缺氧/复氧诱导的PC12细胞存活、凋亡和炎症反应。
综上所述,瑞芬太尼可促进PC12细胞增殖,抑制缺氧/复氧诱导的细胞凋亡、氧化应激和炎症因子的分泌,其机制可能与Akt/mTOR/STAT3信号通路有关。
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