液体活检（Liquid Biopsy）技术的个人详解

液体活检(Liquid Biopsy) 技术的个人详解

首先，我先向大家引入“液体活检”这个名词，对于这个名词的出现也就是最近几年，在临床上对于一般的肿瘤是进行手术活检和穿刺活检，医生需要对患者肿瘤进行切片，这是一种有创的检测，对于操作和取样要求极高，因此，“液体活检”应运而生，它操作简便，且能重复取样，也是MIT科技综述（MIT Technology Review）杂志公布的2015年度十大突破技术之一。

“液体活检”（Liquid Biopsy）或称 “液态活检”，对于实体肿瘤的早期诊断、用药监控、预后判断等的重要性已经日趋明朗。癌症病人血液中会存在少量游离的循环肿瘤细胞（CirculatingTumor Cell，CTC）且坏死的癌细胞亦会释放少量的循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）到血液中，因此可通过检测从肿瘤原发或转移部位释放到血液中的CTC和ctDNA来检测癌症。

目前“液体活检”按照检测样品分类，主要有两大方向：循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, CTCs）和循环肿瘤核酸（circulating tumor DNA, ctDNA）。CTC在上一期我已经跟大家具体介绍了，那么为什么称CTC为“液体活检”呢？因为CTCs是由肿瘤原发灶和转移灶的细胞构成的，随着对肿瘤进展中的生物学变化的了解，通过外周血检测CTCs能够实时、动态的实现癌症的辅助诊断、治疗监测、复发转移监测、预后判断，因而CTC可以作为一种“液体检测”手段。

这一期我主要介绍“液体活检”另一种手段：cfDNA 。在介绍之前我先跟大家解释几个名词：

cfDNA（cellfree DNA），或者叫血浆游离DNA，是血浆中游离存在的DNA，它们有的来自于正常细胞，有的来自于异常细胞（如肿瘤细胞），还有部分来自于我们外部（如病毒DNA）。

ctDNA（circulating tumor DNA），即循环肿瘤DNA，从字面意思来讲，指的是由肿瘤细胞释放到血液循环系统中的DNA。

cffDNA（Cell-free fetal DNA），即母体外周血提取胎儿游离 DNA，通过cffDNA进行筛查，如唐氏综合征，Rh血型，性染色体异常，以及胎儿性别。

    在此顺带插入介绍一下cffDNA，1997年，香港中文大学的卢煜明教授发现孕妇外周血中存在着胎儿的游离DNA，从而开创了无创产前诊断（NIPT）的新时代，无创产前基因检测现在还无法代替羊水穿刺，无创基因检测的特点，主要是弥补了普通唐筛准确性低所带来的许多无谓的羊水穿刺检查，并且弥补了许多无法进行羊水穿刺的孕妇检测唐氏儿的空白，羊水和绒毛穿刺都是一种侵入性的技术，有一定的流产风险，并不能全面推广，只能要求高龄、高危的孕妇检测。无创基因检测是2010年才开发出的新技术，而且基于其检测原理与临床应用的时间，还不能作为最终诊断标准（即使准确率有99%），羊水穿刺才能作最终诊断。

     ctDNA的发现还要早于cffDNA，早在1947年，比DNA双螺旋结构发现还早6年的时候，Mandel和Metais就发现血浆中存在游离的核酸分子；1977年，Leon等人发现，肿瘤患者的血浆游离DNA水平要明显高于健康人群；可是，又过了17年，人们才发现这种携带了突变信息的循环DNA是肿瘤的标志。人们逐渐明白，cfDNA中携带肿瘤特有突变的那一小部分DNA，确确实实是由肿瘤细胞释放出来的，ctDNA的研究终于与肿瘤关联起来。

ctDNA和蛋白类标记物相比，前者的检测更灵敏，很少出现假阳性，可跟踪肿瘤的消失、扩散和复发。只需从受检者体内抽取外周血，根据受检者血液中是否含有某种肿瘤特异的游离DNA及数量的多少，精准的确认相应基因的突变频率，达到早期筛查、监控、监测疗效的目的。

ctDNA是一种无细胞状态的胞外DNA，存在于血液、滑膜液和脑脊液等体液中，其主要是由单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成，以DNA蛋白质复合物或游离DNA两种形式存在，血浆中ctDNA的含量很低，中位值在1%-4%之间，25%的患者接近或低于0.1%，血浆中肿瘤DNA的拷贝数也较低，中位值在50-100拷贝/mL。因此对于ctDNA的检测灵敏度要求也极高。与组织活检相比ctDNA检查微创小、无放射性污染、经济、新DNA无防腐剂污染等优点，并允许对治疗反应实时监测。

ctDNA的主要检测手段也就是增加测序深度（Sangere测序或NGS）、ddPCR（数字PCR或微滴PCR）、qPCR/Rt-PCR等。