TALEN在异染色质区展现出比Cas9更出色的基因编辑效果

基因编辑技术是一种对某一核苷酸序列中的特定基因位点进行人为改变，插入、删除、替换或修饰基因组中特定目的基因，使其表达性状改变的新兴分子生物技术。高效精确的基因编辑工程技术对于发展基因治疗，建立细胞和动物疾病模型具有极为重要的价值。

基因组编辑主要依赖于对目标位点的选择性识别。近年来，基因工程领域常用的编辑工具包括锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs，TALE-nuclease，TALE接上核酸酶）和规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9（CRISPR-Cas9）。其中，CRISPR/Cas9和TALEN都可以识别特定的DNA序列进行编辑，但他们对于目的序列的结合机制却截然不同。CRISPR/Cas9系统通过PAM基序及sgRNA进行目的基因的识别，而TALEN是由长度为33-34个氨基酸的多肽串联组成的可定制的多肽列，每个小单元均可识别特定碱基，通过人为的排列组合即可识别一段特定的DNA序列。

前不久，美国伊利诺伊大学香槟分校赵惠民教授团队在Nature子刊上发表了一篇题为“TALEN outperforms Cas9 in editing heterochromatin target sites"的研究论文，研究人员通过分析活细胞中单个蛋白质分子的运动轨迹，观察了dCas9和TALE蛋白在体内不同染色质环境中的识别过程，并且描述了TALE和dCas9在常染色质和异染色质区域的局部识别机制。结果表明，针对不同异染色质和常染色质位点的Cas9和TALEN变体的TIDE分析，TALE在异染色质区域的识别效率比Cas9高5倍，TALENs比Cas9更有效地修饰了50%的异染色质位点(顶部)。但Cas9在常染色质区(底部)的编辑效率高于TALEN。

该研究使用单分子成像和基于测序的编辑分析的组合来研究TALE和Cas9蛋白在活细胞中的搜索动力学。TALE和dCas9表现出两种主要的搜索行为。三维扩散和跳跃被称为全局搜索，而一维滑动和跳跃（<5bp）被称为局部搜索。结果表明，TALE蛋白使用局部搜索和3D扩散的结合来寻找它们在哺乳动物细胞中的靶位点。此外，dCas9蛋白在DNA上寻找目标位点时也表现出局部搜索的行为。

单分子成像分析表明，不仅dCas9和TALE的搜索机制适应不同的染色质环境，它们在局部搜索的程度上也有显著差异。Cas9在常染色质位点切割更有效，因为它在相对不受阻碍的环境中查询结合位点的能力更强。局部搜索较强Cas9的在异染色质中限制了功能，导致切割效率降低，而TALEN可以更容易地在异染色质中行使功能，因为其不依赖局部搜索进行识别。

另一方面，TALE独特的旋转解耦DNA搜索机制和相对较少的局部搜索使其能够正常识别哺乳动物细胞核中紧密的异染色质结构。dCas9必须解开DNA双螺旋才能进行靶向识别，而核小体阻碍了Case9的局部搜索。且TALEs比Cas9更有效地确定异染色质的位置。因此，TALE能够以比dCas9更高的效率找到嵌入哺乳动物异染色质的靶位点。

此外，使用单分子成像研究TALEs和dCas9靶向Alu序列和着丝粒在哺乳动物基因组显著异染色质结构元件中的搜索过程表明，着丝粒的靶位点高度重复和集中，可观察到TALE和dCas9蛋白的“跳跃”样（短期的“解离-再结合”事件）行为。这种跳跃行为是因为dCas9分子附近有相似位点存在。而Alu序列相对不集中，散布在整个基因组中，从而dCas9不表现出跳跃行为，这表明这些蛋白质在异染色质中的靶搜索过程是根本不同的。由于Cas9的PAM依赖性，以及异染色质区域的限制性，相对于某些情况的基因编辑，TALEN无疑是更理想的高效工具。

参考文献：

Jain S, Shukla S, Yang C, Zhang M, Fatma Z, Lingamaneni M, Abesteh S, Lane ST, Xiong X, Wang Y, Schroeder CM, Selvin PR, Zhao H. TALEN outperforms Cas9 in editing heterochromatin target sites. Nat Commun. 2021 Jan 27;12(1):606. doi: 10.1038/s41467-020-20672-5. PMID: 33504770; PMCID: PMC7840734.