MassARRAY实验​操作流程

MassARRAY实验操作流程

一、引物设计

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之前使用www.mysequenom.com网上工具设计，自从被Agena收购后，网址则变更为www.agenacx.com，不过两个网址的最终连接都是https://www.mysequenom.com/Home，设计的iPLEX的话需要rs号或序列即可（操作具有一定难度，后面如果有时间会详细介绍）。

二、扩增引物和UEP引物的稀释：

1.合成回来的扩增引物（扩增引物合成为2 OD）加去离子水，稀释为100 uM的储液，之后等体积混合使得终浓度为0.5 uM。如做X个Plex的反应，共2*X条扩增引物。每条引物取2.21 ul混合共2.21*X ul，最后补水至442。V水= 442-2.21*X，即为引物Mix（0.5μM）。

2.合成回来的UEP引物（UEP引物合成为4 OD）加去离子水，稀释为400uM的储液，之后按照“UEP引物稀释表”中的黄色部分输入：ID号，Assay的命名（SNP位点的rs号），Original 引物浓度，UEP引物的Mass，总共有n 个Plex信息。根据表格计算出每管需要取多少体积引物进行充分混合，然后补充V水，即为UEP Mix。

三、DNA样品准备

基因组DNA样品（血液、口腔DNA等）抽提之后应用紫外分光光度计进行浓度测定。然后用去离子水或Tris-Cl稀释为浓度10-20ng/ul。由于样品量大，必须做好样品标记，尽量分装在96‍孔板中保存，方便后面384管进行分装。

四、PCR反应

1. 在384孔板上一定要做好标记：横6，纵4的24个孔为一组，以一组为将来点样时候的一针。

2. 按下表配置Mix。配置时按多出来10-15%的量来配制Mix，如需检测40个样，则配50-55个样的量。

备注：血液DNA样本配置Mix需要加水，按如上表格配置即可。

      口腔DNA样本配置Mix无需加水，上表中1.8 ul水去除即可。

3. 在384孔板中每孔加入1 ul模板DNA，最后在加入4 ul Mix （血液DNA样本量：1~1.5 ul均可，加PCR Mix量为4 ul，口腔DNA 样本量：2.4~3.0 ul均可，加PCR Mix量为2.2 ul）（384板，四个拐角处需要多加1.5ul PCR Mix，防止后面PCR反应热蒸发）。

4. 用ABI的PCR封口膜封紧，防止样品蒸发。（本实验的每一步反应揭开PCR封口膜后都应该换一张新膜）。

5. 将384板用Vortex混匀后甩离（2000rpm 1~2min）。

6. 在ABI9700 PCR仪上进行如下反应：

反应结束时，取出384 PCR反应板。

五、SAP消化反应

1. 取出PCR后的板子2000 rpm离心1min。

2. 按下表配制SAP酶Mix，按多出10-15%的量配制。

3. 384板每孔加入2ul的SAP酶Mix，封口膜封紧。

4. 将384板用Vortex混匀后甩离。（2000rpm 1~2min）

5. 在PCR仪中进行SAP酶消化：

      37℃      40min

      85℃      5min

      4℃        hold

消化完毕，取出384孔反应板，目测液体挥发情况。

六、UEP延伸

 1. 取出SAP反应板2000rpm离心1min。

 2. 按下表配制延伸Mix，按多出10-15%的量配制。

  3. 384板每孔加入2ul的延伸Mix，封口膜封紧，Vortex混匀甩离。

  4.在PCR仪上进行下列反应：

反应完毕，取出384孔反应板，目测液体挥发情况。

七、树脂纯化

1. 将384板2000rpm离心2min，目测每个孔的液体体积是否一致，然后每孔加16ul水，封口膜封紧，再2000rpm离心2min。

2. 取一张干净的A4纸，将6MG 384板置于其上，用小勺取适量resin。用塑料盖板反复左右推平resin，压实，使每孔树脂含量均匀。

3. 384板倒过来压在6MG 384板上（由于液体表面张力，384板翻过360度依然不会有产物漏掉）。两板对调，6MG板在上。敲打6MG板背面，使树脂落入装有单碱基延伸产物的384孔板中。封口膜封好装有单碱基延伸产物和树脂的384板，15rpm，15min，上下颠倒板子，使树脂在水中分散好，充分纯化。（注：实际操作中ABI 9700随机自带的和中心实验室订的ABI 384孔板均有四个小的塑料突起，妨碍了与6MG板的贴合，用刀片切去后即可）

4. 机械臂点样之前离心2000 rpm，5min。

八、上机检测

（SEQUENOM 仪器每个星期需要进行一次周洗，每天要进行一次日洗）

 1. 点样机械臂24个针的清洗：

   （1）每周用1M NaOH浸洗10min；具体步骤如下：

在384孔板的左上24孔(横6，竖4)，每孔放入1M NaOH 30ul，注意不能有气泡，（如有气泡可离心2000rpm，1min除去）。打开玻璃窗，把384孔板安置到MTP1位置上，A1的位置放于左下角，关闭玻璃门，输入用户名和密码（均为operator）进入主界面，点击图标TOOLS，再点击图标WEEKLY，周洗完了后。（板子用去离子水洗净，晾干后可保存反复使用）。

（2）连续使用，每天用100%乙醇（分析纯）浸洗30min；具体步骤如下：

①进入主界面；

②点击排去50%实验乙醇；

③点击，使得点样臂移到右侧，以便取出容器。在容器中灌好的100%乙醇，重新按好；

④点击进入界面，点击开始30min的浸泡，屏幕上会出现倒计时；

⑤浸泡时间结束后，点击排100%乙醇；

⑥点击，在容器中放入50%乙醇；

⑦点击进入界面，点击Complete Cycle清洗一次，点击back回到主界面，可用于测样。

2.样品板编制：

1.在右侧数据库电脑上，打开Typer4.0的图标软件,可出现一个MassARRAY Typer的图框，其中有四个小的icon。

2. 然后我们打开Plate Editor对板子进行设置。界面如下。可见三级目录：Custom，Project，plate。

3. 通过右键方式建立Custom及Project，或者用以前建立好的都可以。之后用右键方式建立Plate（plate-Baizhen XTM-JLJCB-右键NEW-新plate-2015XXXX-OK）。

4. 之后在左下角的标签中选择Sample，打开的标签页面中有四级目录：

Sample Customer,

Sample Project,

Sample Group,

Sample

5. 用右键方式建立新的Sample Project,命名一个新的Sample Project ID（或者用已建立好的project也可以）。

6. 右键方式建立新的Sample Group，并输入相应的Sample文件。（在上机之前需要把每个项目的各个基因的SNP位点rs号分类好（一般SEQUENOM会在设计UEP引物的时候自动对某个基因的SNP进行分类）并和384孔板的排版顺序一起发到上机的数据库电脑上（不能为EXCEL表格格式，只能为TXT格式）），输入完成的如下图。

7. 之后需要将Sample指定在Plate中。并排布成我们打质谱时候所需要的布局（sample-20100303-选择Up/Down-Apply template-top 192-右键选择未加样的孔，去除）。 

8. 在左下角的标签中选择Assay，打开的标签页面中有四级目录（直接选中孔的位置，并选中要检测的项目，“Add”即可。保存Plate设置（Assay-Baizhen-选中孔的位置-Add类型 WA-1/WA-2-Add plex-save）。

3. 点样：

待检测样本信息编制好以后，放样品，板的字母对着自己（板上膜一定要撕掉），

①进入主界面；

②点击Mapping选择384MTP→24 Pins→384Spectrochips→选择芯片数（1或2）→选择384孔板的一针对应的芯片位置→保存Mapping文件，赋予一个文件名

③点击Methods→在Mapping File选中前面命名的mapping文件→在Analysis中选中volume check，点击aspirate/dispense进入相应界面改变参数（一般最常调节的是dispense速度，75-90常用）。→点击back返回主界面；

④点击TRANSFER进入点样界面→选择Methods文件名→取出芯片，在芯片的袋子上记录芯片Barcode号，并在包装袋子上标记用过的针的位置（每张芯片总共有16针）。把芯片装入点样仪上→按step/run开始点样（放芯片进入，条形码对着自己）。（最好议用Step方式点样，以便根据每针情况调整aspirate/dispense参数。调整好了把volume check 前的勾去掉，直接点击run就可以了，点样过程中，记录实验数据（即打出的点的Volume值）。Volume值在5-10左右为佳。一般体积3-20ul是正常的。 

4.质谱仪的使用：

1. 在左侧电脑点击图标Typer Chip Linker。

2. 出现下面的对话窗口

3. 左边目录树中选择编号的板子。在Terminator Chemistry下选择iPLEX。Process Method中选择则Genotype+Area。输入Chip Barcod。点击Add。再点击Create。

则在C:Data Process\Input目录下生成临时文件，质谱仪运行中调用，完成后自动删除。

4. 点击桌面图标Start RT Process。

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将自动打开三个窗口。整个检测过程中不要关闭窗口。

5. 在GenoFLEX窗口中File菜单下选择Select Method，再选择iplex.par（如果做甲基化则选MassCLEAVE.par）

6. 在SpectroACQUIRE-iPLEX窗口中，进入Auto Run Set Up页面。

1、输入Barcode号。

2、点击High Voltage关闭高压（红色开，棕色关闭）

3、如果芯片上没有校正试剂，去掉Use Calibration Wells选项。

（在SEQUENOM质谱仪上先点击一次，听到咯的一声后打开金属盖，将芯片放在芯片槽中，然后再点击一次，待质谱仪变绿色后，就可以开始检测了）在SpectroACQUIRE-iPLEX窗口中，进入Auto Run页面。

7. 点击Start Auto Run，即可开始通过质谱进行检测。（待实验结束取出芯片后记住一定要再点击一次，保证SEQUENOM仪器上的指示灯为绿色即可）。

九、数据分析

       后面如果有时间，我会认真研究下MassARRAY在线和离线引物设计，然后撰写一份详细的MassARRAY设计方案。