环状RNA在脑缺血性损伤中作用机制的研究进展

【综述】

环状RNA（circular RNA, circRNA）是一类长度在200~10万nt的非编码RNA，在神经系统中含量丰富，参与神经细胞发育、分化、物质转运及轴突可塑性调节。circRNA种类繁多，作用机制包括竞争性结合微RNA（microRNA, miRNA）和RNA结合蛋白（RNA binding protein, RBP）等，大量研究证实circRNA广泛参与脑缺性损伤的调控。

研究发现，circRNA是非编码RNA中的一种，最早于20世纪70年代末，Hsu和Coca‑Prados 在类病毒研究中首次报道。后来又陆续在仙台病毒、酵母、四膜虫中观察发现circRNA的存在 。随着高通量测序技术的应用，大量研究报道了在秀丽隐杆线虫、果蝇、老鼠及人类等不同物种中均发现多种circRNA的表达 。最初认为circRNA是基因异常剪切的转录副产物，对于circRNA并未予以过多关注。随着转录组学和生物信息技术的发展，对人类成纤维细胞转录组基因的研究发现，circRNA的产生主要由生物体内14.4%的蛋白质编码基因转录后剪切形成，表明人成纤维细胞中超过1/8的蛋白质编码基因能够通过转录后剪切生成circRNA 。Wang和Wang 通过构建包含绿色荧光蛋白的单外显子微基因也发现，前体RNA确实通过高效的反向剪切在人和果蝇细胞中产生circRNA。可见circRNA并非基因错误剪切产物，而是物种进化过程中基因自我表达调控、适应外部环境的调节过程，具有高度特异性和物种间进化保守性。

关于circRNA的形成机制，目前认为主要由套索剪切和直接剪切形成。套索剪切包括套索驱动环化和外显子跳跃，直接剪切包括内含子驱动环化和直接后剪切。通过套索剪切方式产生的circRNAs多由外显子组成，主要位于细胞质中，通过直接剪切方式产生的circRNAs多由内含子组成，主要位于细胞核中。circRNA这两种形成模式的不同之处在于成环机制，套索驱动环化是由外显子剪切供体和剪切受体共价成环，而内含子驱动的环化则是由两个内含子互补配对成环 。同一基因序列可以因为剪切过程中外显子重新排列而产生不同亚型circRNA。circRNA亚型的存在是人类基因表达的一个普遍特征，也是导致某些细胞中circRNA的丰度为其同源线性RNA丰度10倍以上的主要原因 。内含子circRNA（ciRNA）是由内含子组成的circRNA，主要分布在细胞核内，其形成机制依赖于位于5'端含有7个富集GU的序列和位于分支端含有11个富集C的序列的一致性 。外显子跳跃和内含子驱动环化均含有互补性ALU重复序列的长翼侧链内含子。另外当两个外显子相互环化时，位于其间的内含子可能未被剪切，此种由内含子‑外显子circRNA（ElciRNA）同样主要存在于细胞核中。RBP作为连接两侧内含子的桥梁可使剪切受体和剪切供体相互靠近、环化进而促进circRNA形成。如肌肉盲蛋白可与circMB1内含子结合，使两侧内含子桥接在一起，促进形成circRNA 。另外研究还发现其他因素也可以参与circRNA的产生，包括核内不均一核糖核蛋白、植物丝氨酸精氨酸丰富蛋白以及剪切因子Quaking等RBP 。

2.1　对miRNA的“海绵作用”

到目前为止，在数以千计已经识别的circRNA中，只有小部分circRNA的功能是已知的，目前认为circRNA最主要的功能是起到miRNA“海绵作用”。miRNA是基因转录后表达的重要调控因子，miRNA‑ 蛋白质复合物通过直接与信使RNA（message RNA, mRNA）3'非编码区（3'UTR）结合，抑制或刺激靶基因的表达，主要表现为抑制作用。circRNA被称为内源性竞争性RNA，因其富含多个miRNA结合位点，能够吸附miRNA，从而能够抑制miRNA与mRNA 3'UTR结合，上调靶基因表达 。研究表明脑组织中20%的蛋白质编码基因均能转录产生circRNA，这意味着circRNA本身即可能是其同源mRNA产生的重要调控因子，起到类似于“mRNA陷阱”的作用 。小脑变性相关蛋白1能够使哺乳动物体外培养细胞迁移受阻。Wang和Wang 验证circRNA在人体和小鼠脑中高表达的同时发现，存在一个由小脑变性相关蛋白1产生的circRNAs反义转录本，该转录本由外显子组成，包含超过70个miR‑7的结合位点，将其命名为ciRS‑7。研究发现ciRS‑7和miR‑7在小鼠海马神经元内高度共表达，能够以miR‑7依赖的方式与RNA诱导沉默复合体结合，上调miR‑7靶基因的表达，抑制α‑突触核蛋白表达，与帕金森病发病密切相关。另外哺乳动物性别决定基因Sry产生的circSry能够起到miR‑138分子“海绵作用” 。上述两种circRNA基因是具有miRNA“海绵作用”的代表性基因。尽管miRNA“海绵作用”被认为是circRNA发挥生物学作用的主要方式，但是最近一项全基因组研究分析对circRNA这一生物学功能提出质疑。该研究通过分析形成circRNA的外显子与其同源的线性RNA的外显子发现，circRNA没有更多的Argonaute 2（AGO2）蛋白结合位点,并且发现ciRS‑7是目前发现含有最多AGO2蛋白结合位点的circRNA，故其“海绵作用”可能只是某些circRNA表现出的特殊功能，而大部分circRNA并没有结合AGO2蛋白的证据 。除miRNA“海绵作用”外，circRNA还与miRNA的储存、分类及定位相关 。

2.2　顺式调控亲本基因表达

由内含子形成的circRNA对miRNA几乎没有富集作用，进一步研究表明，内含子环化形成的circRNA主要存在于细胞核中，通过与RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ, PolⅡ）相互作用顺式调控亲本基因转录表达。细胞核内circRNA下调可以导致其亲本基因表达减少。ci‑ankre52作为一种由锚蛋白重复结构域蛋白52（ankyrin repeated domain protein 52, ANKRD52）基因内含子环化而成的circRNA，在细胞核内大量富集在亲本基因转录位点，通过反义核苷酸链作用使ANKRD52 mRNA的表达量明显减少 。目前认为该种上调作用的机制与ciRNAs使PolⅡ聚合物拉长有关。例如，circRNA PAIP2是由多聚腺苷酸结合蛋白相互作用蛋白2 基因（poly binding protein interacting protein 2, PAIP2）转录形成的ciRNA，可以上调PAIP2的表达。有研究认为在细胞核中存在大量ciRNA，可能起到43×103 TAR DNA结合蛋白及其他RBP的“海绵作用”，调控基因表达 。ElciRNA同样在细胞核内调控基因转录活性，与PolⅡ、U1小核糖体核蛋白粒子（U1 small nuclear ribonucleoprotein particles, U1snRNP）和启动子相互作用，促进其亲本基因转录。Li等 通过对PolⅡ免疫沉淀样本中的circRNA测序分析发现，在 Hela细胞中，共有111个circRNA与PolⅡ相关，其中表达量最丰富的15个circRNA，包括circEIF3J和circPAIP2，均为ElciRNA。Wan等 也发现，真核翻译延长因子3J产生的内含子circRNA能够与U1snRNP和亲本基因启动子结合，调节亲本基因的转录表达。

2.3　circRNA与蛋白关系

circRNA与蛋白相关的作用包括作为模板翻译蛋白质及与RBP结合发挥生物学功能。最初对circRNA的理解认为，circRNA并不具有翻译蛋白质的功能，但随着研究的深入，人们发现某些位于细胞质中的circRNA含有内部核糖体进入位点序列，且含有开放阅读框结构，因此推测circRNA能够翻译蛋白质 。丁型肝炎病毒的核心包含单股负链circRNA分子，其编码的蛋白丁型肝炎病毒抗原在疾病发展过程中起到重要作用，有力证实了circRNA能够编码蛋白质 。滚环复制指在小分子circRNA上连续进行蛋白质翻译，核糖体在起始位点上沿着circRNA不断进行翻译，产生长链重复核苷酸序列。研究证实在大肠杆菌翻译体系中，具有开放阅读框的circRNA能够以类似于滚环复制的方式进行蛋白质翻译 。目前已建立关于circRNA潜在编码蛋白质能力预测的数据库，该数据库共收集了32 914条人类外显子circRNA，并发现其中有大量circRNA包含编码超过100个氨基酸的开放阅读框，基本符合翻译蛋白质的特征。circRNA与RBP结合调控基因转录是其与蛋白质相互作用的另一重要作用机制，RBP可以作为circRNA形成的激活剂或抑制剂，调节circRNA的表达水平。人抗原R是一种RBP，研究表明在Hela细胞中，hsa_circ_0031288能够竞争性结合HuR，进而抑制其亲本基因PABPN1的翻译表达 。

circRNA广泛分布于心脏、大脑、肝、肾、皮肤等组织器官，且表达具有一定组织特异性，尤其在神经元组织中富集，并且在神经系统发育过程中随着年龄增长而不断积累 。可以发现circRNA在脑组织中高表达主要有以下原因：① 中枢神经系统中含有丰富的circRNA宿主基因，对神经元发育、分化起到重要作用；② 相同circRNA的宿主基因在脑组织中的表达量高于其他组织，或许与神经系统中RBP水平较高，促进circRNA形成有关；③ 神经元基因通常含有长内含子（>10 kb），能够成环的外显子两侧的长内含子含有更多重复序列，更容易形成circRNA。例如，对年轻（1个月）和老年（22个月）小鼠皮质、海马及心脏组织进行RNA序列分析表明，在神经组织衰老过程中，circRNA表达有明显上调趋势；其中circINT（一种由INT基因产生的circRNA）在老年大鼠大脑皮质中表达量明显增高，然而circRNA在脑组织中随年龄增长而积累的现象与其亲本基因mRNA的表达水平并不相关，这表明circRNA可能在老化的神经细胞中发挥重要生物学作用 。

通过比较大鼠脑组织不同区域circRNA表达模式发现，circRNA在海马组织中表达更丰富，且虽然circRNA与mRNA均来源于同一宿主基因，但其表达模式独立于mRNA表达模式之外。例如circRims2、circEl2和circDym在小脑组织中丰富表达，而circPlxnd1在大脑皮质组织中高表达。进一步研究表明，宿主基因在不同脑区表达不同circRNA亚型是导致circRNA在脑组织中高丰度表达的主要原因 。对人类circRNA在8个组织中表达图谱的临床研究表明，在人类大脑皮质中新发现339个circRNA，均由重要的脑组织相关基因剪切而来，其中包括参与神经递质释放的ELKS/Rab6互动/CAST家族成员2基因，在海马体中通过黑素皮质激素调节能量平衡的吸引素样基因1，与突触活动和神经功能紊乱相关的突触后密度体同源基因1及对于维持脊髓小脑共济失调神经元存活至关重要的失调蛋白10基因等 。

circRNA同样与神经元突触活动密切相关，利用γ‑氨基丁酸A型受体拮抗剂诱导小鼠原代神经元中circRNA变化显示小鼠大脑皮质神经元轴突和细胞体中circRNA显著上调，暗示神经元活动变化会对circRNA的形成和转运产生影响，表明circRNA在突触中具有特定功能 。这些积累的数据表明，circRNA在中枢神经系统中起着关键作用，参与神经电活动、突触可塑性、神经退行性变及不可逆性神经损伤的发生发展过程。综上所述，目前研究circRNA在脑中的特异性作用机制包括：① 在应激性损伤中circRNA表达上调，凭借其稳定表达可以作为一种“应激记忆分子”；② circRNA与RBP结合作为蛋白质向轴突或树突转运的枢纽；③ circRNA能够编码储存信息或参与细胞间信息传递。

4.1　circRNA与脑缺血

基于circRNA在脑组织中独特的表达特性，人们通过研究发现，circRNA在脑缺血损伤中同样发挥重要作用。例如，在大鼠大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型中，通过对6个MCAO后大鼠脑组织进行高通量测序分析发现，共有14 694个差异表达的circRNA，并通过PCR证实 mmu_circ_17737基因表达明显上调，而mmu_circ_1059基因表达明显下调 。Liu等 同样对小鼠局灶性脑缺血后缺血部位circRNA进行测序，结果表明在脑缺血/再灌注48 h后，缺血区组织共有914个circRNA表达上调，113个circRNA表达下调，其中部分circRNA通过与对细胞增殖、分化起调控作用的抑制因子活化蛋白1信号通路和丝氨酸苏氨酸激酶信号通路相关。星形胶质细胞作为哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞，对神经细胞起到支持和分隔作用。有研究表明，大鼠MCAO后，星形胶质细胞中circRNA HECTD1基因发生显著差异性表达，并同时在急性缺血性脑卒中患者血清中检测到circRNA HECTD1高表达，进一步分析证实circRNA HECTD1能够竞争性结合miR‑142，上调四氯二苯丙二噁英诱导型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶基因的表达，从而诱导细胞自噬，抑制星形胶质细胞活化 。内皮‑间质转化可以导致血脑屏障功能破坏，Bai等 对circRNA研究发现，circDLGAP4基因能够作为内源性miR‑143“海绵”，通过该作用网络抑制紧密连接蛋白和间质细胞活性，抑制内皮‑间质转化，减轻急性脑缺血血管损伤。

4.2　circRNA与脑缺血/再灌注

在一项模拟脑缺血/再灌注损伤的体外实验中，对氧糖剥夺/复糖复氧（oxygen‑glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R）小鼠海马神经元模型中circRNA表达分析证实，小鼠海马神经元细胞OGD/R后有15个circRNA表达发生显著改变，生物信息学分析表明其中circ_015947基因显著上调，预测该circRNA能够起到miR‑188‑3p“海绵作用” 。Mehta等 对大鼠局灶性脑缺血90 min后不同再灌注时间点大脑皮质circRNA表达检测发现，在再灌注6、12、24 h后，至少有283个circRNA在一个缺血时间点发生改变（差异倍数>2），而有16个circRNA在3个缺血时间点均发生改变，预测其中mmu_circ_016423基因有623个miRNA结合位点，circ_016423基因有521个miRNA结合位点，并通过转录因子分析软件推测在16个变化的circRNA中，有13个circRNA含有插头转录因子结合位点 。因此转录因子可能参与介导了脑缺血后circRNA的改变。脑缺血与叉头框蛋白O3转录因子及circRNA之间影响关系仍需进一步研究证实。脑缺血后circRNA表达变化所产生的分子功能主要对代谢过程、细胞通讯及蛋白质、离子和核酸的结合产生调控作用，因此circRNA未来可能成为保护缺血性脑卒中和其他急性中枢神经系统损伤的重要治疗靶点。

随着生物科学技术的发展，circRNA以其独特的结构和高表达量逐渐进入人们视野，尽管大量研究已经证实circRNA是生物体内一种重要的基因表达“调节剂”，但对于疾病如何影响circRNA表达，其表达的调控机制及降解途径目前仍不明确，需要进一步探索研究。卒中以其高致死率、致残率已经成为危害国民健康的主要致病因素，而对circRNA的深入研究为我们对脑缺血及缺血/再灌注后的治疗提供了一条新的途径。完善微阵列及基因测序技术能够为后续研究提供重要依据，目前对circRNA与脑缺血的关系仍处于大数据统计下数量变化层面，如何建立完整调控体系及应用于临床治疗仍需更加深入研究。

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