RainDance dPCR技术方法

2021

03/02

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PrecisionMed_RainDance dPCR技术方法

RainDrop dPCR俗称为雨滴式数字PCR，或者简称为数字PCR，即 Digital PCR（dPCR）。（RainDance Technologies公司产品）

2013年初，RainDanceTechnologies公司推出了新一代的数字PCR系统RainDrop^TMDigital PCR。这一新型系统在PCR分析的灵敏度、多重分析和绝对定量等方面表现优异。

前面介绍了以血液中的cfDNA或ctDNA为检测对象（液体活检），能很好地克服部分情况下病症组织难以获得的困境，样品的收集是无创或微创的，可以随时采样，对病灶相关biomarker实时掌握，解决了肿瘤进展及治疗过程中时间维度上的异质性；血液内的ctDNA能综合地反映肿瘤整体情况，排除空间上的异质性。目前已经有相当数量的文献对于不同肿瘤的研究证实，血液ctDNA的检测与组织样品的检测呈现非常好的相关性，换句话说，通过血液样品中ctDNA的分析能够反映病灶肿瘤细胞的整体水平。

RainDrop^TMDigital PCR该平台基于RainDance专利的RainStorm微液滴(Picodroplet)技术，这种独特的技术优势，将推动癌症研究、循环肿瘤DNA的检测以及非侵入式产前检查等领域的发展。

当然技术难点也显而易见：cfDNA本身高度片段化，血液内含量非常低，约5~50ng/ml血浆，且其中99%的DNA是野生型的。现有检测手段的灵敏度往往不够，根据2015年7月31日国家卫计委个体化医学检测技术专家委员会制订的《肿瘤个体化治疗检测技术指南（试行）》，各项技术的灵敏度如下：毛细管电泳测序约20%；NGS约10%；焦磷酸测序约10%；定量PCR约10%，ARMS PCR检测方案可达0.1%，QX200微滴式数字PCR可轻松到达万分之几的水平，检测灵敏度方面数字PCR的优势明显。这种情况下数字PCR作为一种全新技术，天然地与“液态活检”的概念捆绑在一起。“液态活检”提出了新的检测对象，“数字PCR”为这种新的检测对象提供了革命性的检测方法。

数字PCR（dPCR）是一种核酸检测和绝对定量的新方法。它与qPCR使用同样的反应试剂，但是以数字化的形式计算独立目标分子的总量，符合需要高敏感度以及珍贵来源样品的实验要求。

同传统PCR以及qPCR相比，数字PCR增加了一步分液(partitioning)的操作，将几十微升（50ul）的PCR反应体系分隔成了众多微小的、独立的反应体系。核酸模板在这种分液的过程中被充分稀释，理想状态下每一个小反应体系中至多含有1个分子的核酸模板。对于RainDrop数字PCR来说，基于其专利的RainStorm技术，RainDrop系统能够将50微升PCR反应体系快速、均一地制备成100-1000万个皮升大小的油包水液滴，确保了真正的单分子扩增。分液完成后，收集所有液滴进行常规的PCR扩增，可以在其背景高达250,000个野生型拷贝中，检测单个突变拷贝。和qPCR不同，数字PCR不对扩增过程进行实时监测，而是检测end-point的荧光信号。扩增完成后所有液滴的荧光将逐个被识别并进行计数，不需要构建标准曲线，就可以得到绝对定量的结果。RainDrop系统还能从dPCR模式中每个标志物的一种颜色转化为两种并且根据不同探针强度的方法，实现最多10个标志物的多重分析。

目前在基因组学和遗传学领域，对高通量同步分析多个目标的需求不断提升，同时在医药相关的如诊断领域，也需要更高效的利用有限量的样品，因而在同一反应体系中进行多重反应和定量多种目的片段，是PCR技术发展的主导方向。现有的qPCR系统大多可支持同步检测4种荧光素，然而由于多重引物和探针的组合对PCR反应动力学的影响，现实中多重分析通常难以实现，或需要进行复杂的条件优化。

RainDrop数字PCR具有VIC和FAM双通道荧光信号检测系统，其荧光信号的获得是基于Taqman探针原理，通过调整此两种荧光素探针的使用可以轻松地实现多重分析。基本原理如下示意图：针对多个目的片段分别使用VIC标记、FAM标记或混合两种荧光素标记的探针，检测时带VIC荧光、FAM荧光或同时带两种荧光的液滴将被相应辨识出来，分别被计数。基于此原理，在保证荧光信号强度与探针浓度成正比的前提下，调整荧光素的浓度以及调整两种荧光素混合时的配比，可以在一个反应中达到多至10重的分析。