Hedgehog信号通路抑制剂/激动剂临床前药筛平台

Hedgehog（Hh）信号通路是胚胎发育所必需的，在成人组织维持、更新和再生过程中起到关键作用。异常激活的Hh信号通路与基底细胞癌、成神经管细胞瘤和横纹肌肉瘤、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌及乳腺癌发生发展相关。作为发育、干细胞、肿瘤领域的关键通路，近年来靶向Hh信号通路药物开发成为热门。[1]

当Hh 蛋白通过结合典型受体 Patched (PTCH1)起始信号转导抑制Smoothened（SMO），致SMO 的聚集和磷酸化。SMO 介导下游信号转导，诱导 GLI 蛋白从SUFU上分离下来，进入细胞核启动一系列基因的转录。（图1）

靶向Hh信号通路药物开发，有几类策略[2]：

（1）阻断配体（sHh）蛋白或者表达;

（2）靶向抑制Smoothened（SMO）;

（3）抑制Gli转录抑制剂。

已经有靶向Hh信号通路药物开发的研新药项目，其中3款药物已上市。除了已经上市的药物，处于临床开发期的SMO抑制剂更多。较具有代表性的药物有：BMS-833923、LY2940680、TAK-441等。

可见，Hh通路抑制剂在发育、干细胞和癌症疾病领域发挥着巨大作用，包括辉瑞、诺华、礼来等诸多制药巨头都参与了该药物领域的争夺。随着Hh通路与其他通路的联合应用研究，越来越多的适应症会被开发，是非常值得期待的靶点。

1. 报告基因检测（NIH3T3-GRE-Luc Reporter Gene Assay）

本检测是在稳定转染GRE-Luc质粒的NIH-3T3细胞系中，评价对Hh通路的激活和抑制能力。GRE-Luc质粒是把8段串联的Gli responsive element(GRE)序列，装在荧光素酶启动子位置。一旦Hh通路被激活，NIH3T3-GRE-Luc细胞就会表达荧光素酶，通过检测荧光素酶的水平，评价Hh通路的激活或者抑制。[3, 4]

2. SMO竞争结合实验（BODIPY-cyclopamine Binding Assay）

本检测是在稳定转染SMO蛋白的Hek293或者U2OS细胞系中，评价化合物竞争结合到SMO蛋白上Cyclopamine结合位点的能力。Bodipy-Cyclopamine是一种荧光基团修饰的Cyclopamine，可以结合到SMO蛋白。

3. 细胞向成骨分化实验（Alkaline Phosphatase Assay）

本检测是在小鼠间充质干细胞C3H10T1/2细胞系中，加入重组sHh蛋白或者Hh通路激动剂（SAG），诱导间充质干细胞干细胞成骨分化。碱性磷酸酶（ALP）作为成骨分化的早期标志物。通过检测ALP的活性，评价化合物对成骨分化的抑制效果。

SMO-D473H突变是在一位维莫德吉获得性耐药髓母细胞瘤(medulloblastoma)患者组织中发现的耐药突变。[5]

1. 293T-hSMO-D473H(耐药突变)：293T细胞稳定表达人SMO耐药突变蛋白。

2. U2OS-hSMO-D473H(耐药突变)：U2OS细胞稳定表达人SMO耐药突变蛋白。

• 适应症发现和拓展：科途医学提供候选药物的临床前适应症筛选服务。在临床试验之前，Hedgehog通路候选药物可以在20余种肿瘤中，快速评价候受试药物在各癌种的响应率，为临床试验的决策提供数据支持。

• 生物标志物发现：通过对类器官敏感模型和耐药模型的多组学分析，发现药物敏感性相关的生物标志物。

• 联合用药和耐药性研究：在双药联用和多药联用的临床试验中，通过类器官的药物协同效应评价，可能找到最佳的临床组合设计方案。Hedgehog通路和很多药物耐药相关，开展耐药和联合增敏研究，可以找到复发耐药患者群体作为临床试验适应症。