文献精读 | 在阿尔茨海默症疾病模型中类淋巴系统功能及其tau蛋白清除能力受损

    阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease，AD）的病理特征主要包括：细胞外Aβ蛋白斑块沉积、细胞内tau蛋白过度磷酸化导致神经元纤维缠结（NFTs）。近期研究提示，类淋巴系统作为一种脑实质中蛋白的清除途径，可能在清除这些异常蛋白中发挥着重要作用。

    类淋巴系统的主要特征包括：动脉旁间隙内脑脊液（CSF）与脑实质中组织液（ISF）的流通交换、静脉旁间隙则作为清除通道。其中星形胶质细胞终足上的水通道蛋白AQP4在其中发挥重要作用。既往关于类淋巴系统在AD模型小鼠中的研究中主要集中于Aβ蛋白清除上。但在AD病人中，tau蛋白的负荷才是预测脑萎缩和认知状态的指标。越来越多的证据表明细胞外间隙作为一种“管道”，使得这种tau蛋白的异常变化在神经元之间传播或者局部发展。而细胞外间隙中的异常蛋白正是由类淋巴系统所清除。因此类淋巴系统对tau蛋白的清除功能降低可能是导致疾病进展的原因之一。

      本研究采用AD模型小鼠（rTg4510小鼠），通过MRI、脑实质注射、CSF采样、AQP4功能调控等多种手段，评估其小鼠脑内类淋巴系统的功能、对tau蛋白的清除能力以及AQP4在这一过程中的作用。

      rTg4510小鼠的转基因表达受到CaMK2a启动子驱动，在早期的tau蛋白沉积阶段局限于前脑。CaMK2a在小鼠所有皮质中的表达呈均质性（Fig. 1B），因此tau蛋白的沉积理论上应为相同的。然而通过PG-5（Tau pS409）免疫组化分析，在3.2-4.6月龄小鼠中，头侧的皮质相对尾侧的皮质呈现更明显的tau蛋白病理变化（Fig. 1C-F）。PG-5的免疫反应率在更靠近头侧的皮质（躯体运动皮质）相比更靠近尾侧的皮质（视觉皮质）之间差异则更为明显（Fig. 1F）。头侧皮质与尾侧皮质之间的PG-5免疫反应率的比值随着小鼠年龄的增长而降低，表明这两个区域的tau蛋白沉积的异质性随着年龄的增长而减小（Fig. 1F）。这些结果可能提示相比头侧皮质，小鼠的尾侧皮质清除了更多的磷酸化的tau蛋白。

▲ Fig. 1

      为了探究类淋巴系统中CSF-ISF交换的皮质异质性是否与Fig. 1的发现有关，以及这种异质性是否更容易使部分脑区产生异常蛋白蓄积，作者通过增强MRI成像技术，经野生型健康小鼠小脑延髓池鞘内注射磁共振造影剂（Gd-DTPA），通过分析局部皮质造影剂的变化特征，评估其相应部位的类淋巴功能。与Fig. 1 结果相同，在小鼠的头侧皮质，造影剂信号呈现相对较低的水平，而尾侧皮质则呈现高造影剂信号水平（Fig. 2A-B）。此外，造影剂的渗透效率（最高信号强度/达到最高信号强度一半所需的时间，IntensityMax/ Time50）在尾侧皮质相比头侧皮质更高（Fig. 2C），反应了类淋巴系统在皮质的不同区域的异质性。

      为进一步探究这种异质性现象，作者通过分别向野生型小鼠头侧皮质和尾侧皮质注射含tau蛋白的脑组织匀浆，并在注射后60min抽取通过小脑延髓池行CSF采样检测tau蛋白浓度（Fig. 2D）。同MRI观察到的一致，相比于头侧皮质，尾侧皮质中的tau蛋白清除进入CSF更多（Fig. 2E）。

      上述结果表明在野生型小鼠皮质中，类淋巴系统的内流、脑实质内tau蛋白的清除均表现为尾侧皮质比头侧皮质更明显，这与头侧皮质在转基因鼠的早期tau蛋白沉积更明显的结果相一致。

▲ Fig. 2

      为明确在tau蛋白病变和神经退行性病变中类淋巴清除系统的功能，作者采用鞘内注射Gd-DTPA采集一系列T1加权图像，评估8.5月龄的rTg4510小鼠的类淋巴系统功能（Fig. 3A-B）。在该年龄段的小鼠，前脑具有明显的神经元纤维缠结的病理变化，并伴有神经退变和脑萎缩的症状。研究发现rTg4510小鼠尾侧皮质中的造影剂相比野生型小鼠明显减少（Fig. 3Ci），并且IntensityMax减小，而Time50增加（Table 1）。

     在头侧皮质和海马区，相比于野生型小鼠，rTg4510小鼠的时间-信号曲线未见明显差异（Fig. 3Cii-iii）。但是在rTg4510小鼠中，其头侧皮质和海马区则具有更高的IntensityMax和更短的Time50（Table 1），提示在这些tau蛋白负荷的脑区中，其类淋巴系统CSF-ISF交换功能是增强的。

      在不受tau蛋白病变或者神经退变影响的小脑中，野生型和rTg4510小鼠之间的时间-信号曲线、IntensityMax 、Time50并未发现统计学差异，表明小脑的类淋巴系统CSF-ISF交换功能并未受到影响（Fig.3 Civ，Table 1）。

▲ Table 1

▲ Fig. 3

    随后，作者通利用增强MRI的数据，更进一步评估了rTg4510小鼠的类淋巴系统功能（Fig. 4A-C）。rTg4510小鼠的尾侧皮质的造影剂渗透效率相比野生型小鼠下降（Fig. 4C），表明rTg4510小鼠在尾侧皮质的CSF-ISF交换（类淋巴系统功能）受损。在MRI冠状切面，rTg4510小鼠的造影剂进入尾侧皮质的信号下降程度尤为明显（Fig. 4B，白色箭头）。

    为评估CSF-ISF交换减少是否引起tau清除减少，作者通过分别向rTg4510小鼠头侧和尾侧皮质注射含tau蛋白的脑组织匀浆，60min后取CSF样本检测tau蛋白浓度（Fig. 4D）。在野生型小鼠中，尾侧皮质排出至CSF的tau蛋白相比头侧皮质更多（Fig. 2E and 4E）。而在rTg4510小鼠中，头侧皮质排出至CSF的tau蛋白浓度相对于对照组更高，而尾侧皮质注射的小鼠其CSF中tau蛋白浓度相对于对照组则没有统计学差异（Fig. 4E）。

     作者随后在mRNA层面和蛋白层面检测AQP4表达差异。在mRNA水平，rTg4510小鼠的头侧和尾侧皮质的AQP4表达相比野生型小鼠均明显升高（Fig. 5A）。然而在蛋白层面，rTg4510小鼠仅有头侧皮质的AQP4表达相比野生型小鼠有差异，而尾侧皮质两组小鼠间无统计学差异（Fig. 5B-C）。通过对尾侧皮质进行AQP4和CD31（血管内皮细胞标志物）的免疫荧光染色，观察AQP4在血管周围的表达，发现rTg4510小鼠尾侧皮质的AQP4极性相比野生型小鼠下降（Fig. 5D-F）。这一极性下降的现象在AQP4与GFAP的免疫荧光染色则更为明显，rTg4510小鼠尾侧皮质的血管周围的终足AQP4覆盖减少（Fig. 5G）。

▲ Fig. 4

▲ Fig. 5

▲ Fig. 6

      本文通过观察AD模型小鼠（rTg4510小鼠）早期（3.2-4.6月龄）的皮质中tau蛋白的分布差异，发现头侧皮质tau蛋白沉积更多。在野生型小鼠中，头侧皮质的类淋巴系统功能更弱、tau蛋白清除更少，而尾侧皮质则相反。而在8.5月龄的rTg4510小鼠的尾侧皮质相比于野生型小鼠，类淋巴系统功能、tau蛋白的清除功能则明显受损，同时尾侧皮质的AQP4极性也明显下降。在抑制AQP4后，小鼠的类淋巴系统功能、脑实质内tau蛋白清除也明显降低。上述结果表明类淋巴系统的CSF-ISF交换及其清除脑内tau蛋白的功能在AD模型中是受损的，AQP4在类淋巴系统清除tau蛋白的过程中发挥重要作用，阻断AQP4则会导致tau蛋白清除的减少。