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Nature子刊：让纳米药物载体具有器官选择性，用于递送mRNA和CRISPR基因编辑

2021-02-08 生物世界

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来源 | BioArt

近年来，基于 mRNA 的蛋白质替换疗法和CRISPR/Cas介导的基因编辑在许多疾病的治疗方面具有极大的应用前景。特别是Moderna和辉瑞/BioNtech开发的mRNA新冠疫苗近期已成功得到应用，Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna因“CRISPR/Cas9基因编辑技术”获得2020年诺贝尔化学奖。但是，安全有效的体内递送仍然是制约基因治疗应用的最大障碍。

在RNA递送领域，脂质纳米颗粒 （Lipid nanoparticles, LNP ）成绩突出。2018年FDA批准的第一款siRNA药物 (Onpattro) 和以上两款mRNA新冠疫苗均采用了脂质纳米颗粒 （LNP）递送系统。

虽然现有的研究工作已经取得了一些进展，但是我们仍然需要更加高效和智能的体内递送体系。尤其是，1) 目前最高效的LNPs体系，也仅有1% - 4%的RNA逃出内涵体，内涵体逃逸性能低；2) 现有的LNPs大多具有肝脏靶向，肝脏以外其他器官的靶向、特异性递送问题亟待解决。

2021年2月4日，美国德克萨斯大学西南医学中心Daniel J. Siegwart教授团队 (共同一作为刘帅博士和程强博士) 在Nature Materials上在线发表了题为： Membrane destabilizing ionizable phospholipids for organ selective mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing 的研究论文。

报道合成了一系列具有强内涵体逃逸性能的新型磷脂 (iPhos) 。含有iPhos组分的LNPs （记为iPLNPs）用于递送mRNA或Cas9 mRNA/sgRNA)复合物，取得了极高的体内mRNA递送和CRISPR/Cas基因编辑效率。并且， iPhos磷脂化学结构调控或者 iPLNPs 组分调控均可实现器官选择性递送 。

LNPs通常由磷脂/阳离子脂质/胆固醇/聚乙二醇化脂质四组份组成，之前几乎所有研究均集中在优化阳离子脂质结构上，而当下所用商业化磷脂种类和结构单一。但是磷脂具有其独特的优点，磷脂与生物膜结构同源，具有很强的内涵体膜融合和内涵体逃逸潜力，因此通过化学手段灵活设计结构可控的新型磷脂，为获得更加高效的LNPs系统提供了一个新的思路。作者推测由一个叔胺和一个磷酸基团组成的两性离子头部，结合一个带有三条疏水烷基链的尾部，将有利于磷脂的内涵体逃逸 (图1) 。

图1. 新型磷脂iPhos有助于内涵体膜的相转变，从而提高内涵体逃逸性能。

在酸性内涵体环境下，叔胺质子化，磷脂形成一个较小的两性离子头部和一个较大的多疏水链尾部，插入磷脂膜中形成一个锥形结构，促使膜向六方晶相转变从而实现内涵体逃逸。而在中性生理pH下，整体带负电的iPhos难以插入到内涵体膜中，保证了iPhos材料的低毒性。为了验证这一理论，作者设计合成了572种iPhos 磷脂 (图2) ，其中包含各种两性头部和不同数量的疏水链尾部。体外构效关系结果和膜相转变研究均有效支持了上述理论。

图2. 572种iPhos的合成和体外mRNA递送筛选。

接着，作者进一步进行体内mRNA递送筛选。体内构效关系揭示出很有趣的结论， iPhos结构不仅影响体内转染效率，而且可以控制器官选择性。

结果证明：1) 包含一个可电离叔胺，一个带负电磷酸基团和三个疏水烷基链的iPhos效率最高；2) 叔胺一侧烷基链长度控制着体内mRNA递送效率，8 ~ 10碳链长度iPhos体内效率最高；3) 磷酸基一侧烷基链长度决定器官选择性，9 ~ 12碳链长度的iPhos递送mRNA至肝脏表达，13 ~ 16碳链长度的iPhos递送mRNA至脾脏表达。这一有趣现象表明调控iPhos化学结构可以实现器官选择性，对其它递送体系的设计具有借鉴意义。

2020年，Siegwart教授团队开发了一种器官选择性靶向 (SORT) 技术，在mRNA递送和CRISPR/Cas基因编辑的应用方面发挥巨大潜力，相关成果发表于 Nature Nanotechnology 杂志。借鉴以及运用SORT技术，作者以筛选优化出的iPhos 9A1P9为中心，辅助各种不同脂质，在保证高mRNA递送效率的前提上，实现了器官特异性mRNA递送：9A1P9结合两性离子脂质 (DOPE) ，介导了mRNA在脾脏中表达；9A1P9结合可电离阳离子脂质 (MDOA, DODAP或5A2-SC8) ，使得mRNA在肝脏中表达；9A1P9结合不可电离阳离子脂质 (DOTAP或DDAB) ，实现了mRNA在肺中表达。

值得一提的是，9A1P9-5A2-SC8 iPLNPs在低至0.05 mg/kg Fluc mRNA剂量的条件下，就已达到小动物活体成像系统检测化学发光的上限。9A1P9递送mRNA效率达到商业化磷脂DOPE和DSPC的40 ~ 965倍。

然后，作者以FDA批准的DLin-MC3-DMA LNPs (siRNA药物Onpattro) 作为阳性对照，结果9A1P9-5A2-SC8 iPLNPs体内递送mRNA的效率是DLin-MC3-DMA LNPs的13倍。这些研究结果充分证明了iPhos在mRNA递送方面的优秀性能。

随后，作者使用肝靶向的9A1P9-5A2-SC8 iPLNPs和肺靶向的9A1P9-DDAB iPLNPs进行了mRNA递送和基因编辑的应用研究。作者选用了tdTomato (tdTom) 转基因小鼠，当tdTom基因前的终止信号被Cre酶或者CRISPR/Cas9 切除后会激活红色荧光蛋白的表达，便于检测。

作者对tdTom小鼠单次静脉注射了包裹Cre mRNA的9A1P9-5A2-SC8 iPLNPs和9A1P9-DDAB iPLNPs，通过流式细胞仪测定了不同细胞类型的编辑效率。肝实质细胞的编辑效率高达91%，肺部内皮和上皮细胞的编辑效率分别达到34%和20%。这些结果为mRNA依赖的器官特异性治疗提供了依据。

作者将器官靶向的iPLNPs进一步应用到CRISPR/Cas基因编辑，共递送Cas9 mRNA和sgRNA。一次静脉给药后，肝靶向的5A2-SC8 iPLNPs和肺靶向的9A1P9-DDAB iPLNPs分别成功编辑了tdTom小鼠肝部和肺部，保持了器官特异性。接着，作者对iPLNPs靶向编辑内源性基因 (PTEN) 的能力进行了测试。在C57BL/6小鼠中，一次静脉注射装载有Cas9 mRNA和sgPTEN的iPLNPs后，不仅成功观察到器官选择性基因编辑，而且肺靶向9A1P9-DDAB iPLNPs对肺部的基因编辑效率更是高达28.3%。

最后，作者验证了iPLNPs体系的临床转化潜力：1) 用微流控技术大批量制备了iPLNPs，并且保持了高mRNA递送效率和器官特异性；2) iPLNPs可以重复给药，保持高转染效率；3) iPLNPs体内毒性很低。

总结而言，本研究开发了一系列易破膜新型磷脂，拓展了磷脂的种类和结构，拓宽了LNPs体系。证明了脂质化学结构的调控和纳米颗粒组分的调控均可实现器官选择性，为下一代基因载体的开发提供了思路，将会极大地促进基于mRNA递送和CRISPR/Cas基因编辑的器官特异性疾病治疗研究。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41563-020-00886-0

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Nature,mRNA,载体,编辑,基因,磷脂

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