核酸知识系列（四）

许多人总是担心混匀的剧烈程度是否会对核酸，尤其是基因组 DNA 造成破坏，实际上大可不必如此小心。剧烈的混匀操作，是会对部分打断大分子的基因组 DNA， 但该破坏作用不会强烈到 DNA 变成 10kb 以内的小片段。手剧烈晃动混匀后，基因组 DNA 的片段，大部分会大于 20kb，这个大小，除了一些特别的要求外，对 PCR 和酶切，都是完全适用的。如果要求的片段非常大，如构建文库用，则不能使用剧烈的混匀方法，而只能来回温和颠倒混匀。

几乎没有人会认为 EP 管的质量会与核酸抽提的操作有关，与某些现象（如核酸在-20℃ 保存一天后发生了降解）有关系，但事实是， EP 管的质量的确与核酸抽提的质量以及核酸保存时的稳定性有关。

硅化可以提供最高质量的 EP 管，使某些奇怪的现象消失或者大大减轻。最糟糕的 EP 管对液体有较强的吸附力，在倾倒液体时残留多，核酸在管中保存的过程中会发生变性。这样的管子很有市场的，因为便宜；而正因为便宜，其材料总是不令人放心的。只有硅化过的低吸附 EP 管， 才可能按照标准操作获得满意的结果。否则，某些操作步骤必须调整，才可以获得稳定的质量。

核酸抽提去除蛋白质，先用酚与氯仿抽提，然后再用氯仿抽提。使用两种不同的有机溶剂去除蛋白质比用单一有机溶剂效果更佳。继而用氯仿抽提可除去核酸制品中残量酚。

酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的 DNA 分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。

弊端：酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约 10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的 DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走 DNA。

在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好，经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。

在抽提 DNA 时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为 24：1 之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为 25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份 24：1 的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑 DNA 的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。

磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围（pH），可作 DNA 的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与 Ca^2＋产生 Ca₃(PO4)₂ 沉淀。

在 DNA 反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用 Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存 DNA 时，大都采用Tris-HCl 系统。

TE缓冲液含有Tris-HCl及EDTA两种物质，呈弱碱性，对DNA的碱基有保护性，DNA在TE缓冲液中的稳定性较好，不易破坏其完整性或产生开环及断裂，所以提取好的DNA最好也放在TE缓冲液中保存。

基本上，核酸在保存中的稳定性，与温度成反比，与浓度成正比。虽然也有部分实验人员发现， -20℃保存的 DNA 比-70℃保存的稳定。

如果温度合适，保存中核酸发生降解或者消失，首要原因是酶残留导致的酶解，第二个原因则是保存核酸溶液的 pH 值不合适导致的水解。还有一个就是 EP 管对核酸的影响（核酸一定会与装它的容器的接触面发生反应，达到某种均衡），EP 管的材质，可能吸附核酸，其次还可以诱导核酸的结构发生某些变化，如变性。在核酸的浓度比较高时，这个现象可能观察不到；当核酸浓度很低时，则比较明显了。