NanoString技术方法

2021
02/07

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NanoString 技术方法


NanoString nCounter System是一种高通量的RNA表达检测方法,目前也主要应用在RNA表达量的分析方面。上海地区目前使用该仪器的有交大、复旦、中科院和药明康德四家。

20083月,《Nature Technology》杂志曾以封面文章的形式报道了NanoString的数字基因表达谱技术,可见其非同一般。根据发表在《NatureTechnology》的文章显示,它将此平台与芯片、TaqManPCRSYBRGreen定量PCR进行了比较,发现nCounter系统比芯片更为灵敏,与实时定量PCR的灵敏度相似。研究证明NanoString技术在所有转录本水平的基因表达模式与实时定量PCR有着极佳的关联。

NanoString实验过程解析

1.NanoString实验过程中需要用到的探针是一对、一对的。每对探针分成:Capture探针(捕获探针)和Report探针(报告探针)。

其中capture探针是一段带有50 mer 的核酸及Biotin,能将目标分子捕获并停留在由Avidin组成的Cartridge上。它的作用是把目标mRNA给抓住,并固定到玻璃板上。


Report探针是一段带有50 mer 的核酸及不同荧光颜色排列组合而成的探针,为主要的信号来源。它一方面与目标mRNA相结合。另一方面,它带了一串6个彩色的小珠子,通过小珠子的颜色和排列,光学识别软件可以在后期识别过程当中,把不同的report探针给识别出来,并加以区分、和统计。


2. 每一对探针,都针对一个特定目标基因mRNA。把含有mRNA的样本裂解液与探针进行孵育杂交。让Capture探针和Report探针与目标mRNA相结合

3. Capture探针和Report探针与目标基因的mRNA相互补。其中,Capture探针是对应于目标mRNA5'。而Report探针是对应于目标mRNA3’。【 Capture探针上,带了一个生物素Report探针上,带了一串6个彩色的小珠子】。这个生物素,将与Cartrige的玻璃表面上所包被的链霉亲合素相结合【这个Cartrige也就是反应芯片Capture探针就这样被锚定在玻璃表面。同时,也把目标RNA连同结合在一起的Report探针,一同锚定在玻璃表面。

4. 通过一系列的杂交、洗脱过程,把游离的、没有结合到目标mRNA上的探针,都给洗掉。

5.目前的Report探针上有6个彩色的小珠子,老版的Report探针上会有8个彩色的小珠子。每个小珠子有:红、黄、蓝、绿,4种颜色可选。每个珠子的直径是200纳米。通过珠子色彩的排列、组合,可以得到足够多种多样的变化。但是,相邻的两个珠子是不能同一种颜色的。这样设计,是为了便于后期软件对珠子的颜色进行识别(每次实验,最多可以测800种探针。也就是说一次最多可以测800种基因的mRNA)。

6. Cartrige放到PrepStation光学扫描仪上。在Cartrige上通上电场。因为Report探针上的彩色珠子都是带电荷的,这些珠子就在电场的作用下倒向一边,并且被拉直。


7.光学扫描仪对着玻璃板进行扫描,读取信息。一个Cartrige上有12个通道,也就是一次实验可以做12个样本。每个cartrige的价格在大约900美金。

8.cartridges移动到 Digital Analyzer进行信号数据采集,计数在Cartridge表面上的荧光编码探针并且将其列表标识。



总体步骤大致如下图


NanoString nCounter System还可以用做蛋白水平表达的研究,目前只能做30多种蛋白的表达水平测定,方法的原理是:

1.把与蛋白一一对应的特异序列的单链DNA标签通过一段可以被光解的linker连接到相应的蛋白抗体上;

2.抗体-DNA标签复合物与相应的蛋白结合;

3.收集特异性结合的抗体-DNA标签复合物;

4.光照裂解linker,释放DNA标签

5.利用nCounter的报告探针和捕获探针检测DNA标签的数目,即可得到相应蛋白的表达数量。利用高灵敏度的nCounter系统检测少量细胞甚至单细胞多达800种不同蛋白的表达水平,而这是免疫组化技术和免疫印迹技术所不能达到的。

NanoString nCounter System也可以用来检测microRNA,方法的原理是用桥接的方法,利用一段设计好的,互补的RNA链,把目标microRNA链和另外一个设计好的标签RNA链,杂交在一起。再用RNA链接酶,把这两段RNA连成一根RNA链。连完之后,把多余的桥接RNA、标签RNA都去掉。再用NanoString的方法定量检测。





另外药明康德也用NanoString做肺癌的融合基因检测ALKROS1RETNTRK1),不过只是科研项目,并不用做临床诊断服务项目,市场收费一个样本在3~4千元。

NanoString仪器在国内使用的优缺点:(个人观点

优点

1.可适用于严重降解的RNA样本,如:FFPE样本。石蜡样本当中的RNA,往往是严重降解的,许多分子生物学实验都很难处理,但是NanoString可以很好地分析石蜡样本当中的RNA,最短可以检测到100bp RNA

2.不必抽提RNA,直接可以用FFPE样本的裂解液,或者细胞的裂解液来做实验(只需要100ng即可做出很好的实验结果)。

3.实验全程中无酶参与反应,无需RT-PCR进行反转录,也无需PCR进行扩增,直接检测RNA的分子数量。

4.通量方面,一次最多处理12个样本,每个样本最多测800targets

5.实验操作方面:手工操作部分大概只有十几分钟,其余的步骤,都可以由

机器来完成,自动化程度高,操作简单,重复性好,数据比较精确。

6.荧光条形码探针标记,单分子计数。

7.NanoString另外提供element试剂盒,将应该分子条形码与探针分开,研究者可根据自己的需要灵活合成各种探针,用GPRs与探针杂交后与靶基因杂交,从而对靶基因进行分类和计数(Element方法的原理,就是把Report探针拆成2段。一段是和目标mRNA序列相结合,另外一段,是连到彩色的小珠子。同时,也把Capture探针分成2段,一段是连到生物素的,还有一段,是和目标mRNA相结合的。这样设计的效果,就是只要换中间普通探针的序列,就可以探测不同的目标mRNA了。而普通探针的价格,是远低于Report探针的)。


缺点:

1. NanoString仪器的国内代理商仅台湾冷泉港一家,探针的设计和合成需在美国完成,我们只需提供rs号,探针合成周期大约在1~2个月,时间比较长,合成后需要保存在-70度空运回来,过安检很麻烦,个人觉得成本会很高。

2.NanoString 仪器的一个Cartrige上有12个通道,也就是一次实验可以做12个样本,每个cartrige的价格在大约900美金。

3. 每(一个)反应、每(一对)探针的价格,大概在0.53个美元之间,NanoStringReport探针是比较昂贵的,量多的情况下跟qRT-PCR试剂的masterMix 成本差不多,如果量少就会比qRT-PCR成本高。

4,目前临床和NCCN的金标准是FISH检测方法,该方法只和qRT-PCR方法进行过对比,符合度在0.9999,但是并没有和金标准FISH做过对比(仅有药明康德跟FISH做过对比,并且列数不多),所以以临床形式推出报告可能不太适合,只能以科研形式出具报告。

NanoString的方法,相对于FISH方法,有以下的优点:

· 1NanoString方法能在一个反应当中,把四种基因的、已知的59种融合基因突变类型都检测到,而FISH,一次反应,只能检测一种基因的融合基因突变。

· 2NanoString方法除了能检测已知的融合基因突变还能发现未知的融合基因突变。

· 3NanoString方法的自动化程度相当高,相比于FISH方法,它可以节省大量的人工成本。

· 4NanoString检测结果是由机器来读数,客观程度相当高。

NanoString的仪器,分成一大一小这样两台仪器。大的仪器,是做化学反应(nCounterPrep Station)。小的这台仪器是做光学扫描读数用的(nCounterDigital Analyzer)。


20139月,美国FDA批准NanoString公司的Prosigna方法。Prosigna是针对乳腺癌进行分型,和预后评估的一种方法。这个方法,分析PAM50基因的表达量,PAM50PredictionAnalysis of Microarray 50(的缩写)。它是医学界公认的,可以对乳腺癌进行分型,并且进行预后评估的标准。目前,Prosigna方法,已经在北美和欧洲有较多的应用。在近期,该项panel已经被纳入了美国的保险公司投保范围内了,可见NanoString的技术含量以及美国对生物医疗行业的重视程度了!

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关键词:
mRNA,基因突变,技术,探针,仪器,蛋白,目标

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