数字PCR的应用
2015年随着精准医疗理念的提出,各种技术平台如雨后春笋般涌出,今天介绍下MIT科技综述(MITTechnologyReview)杂志公布的2013年的十大突破技术之一的数字PCR。
近年来,随着人类基因组学的迅猛发展,肿瘤的个性化治疗基因检测已经在临床上广泛应用,实现肿瘤个性化治疗的用药基因检测规范化和标准是一项意义重大的紧迫任务。
为进一步提高临床实验室开展药物代谢酶和药物靶点基因检测技术,以及肿瘤个体化用药基因检测技术的规范化水平,国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会,在广泛征求意见的基础上,制订了《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》和《肿瘤个体化治疗检测技术指南(试行)》,在此次《肿瘤个体化治疗检测技术指南(试行)》中,以QX200
为技术代表的数字PCR技术,已经正式写入进去。
以ctDNA检测为核心的肿瘤个性化医疗组成了一个生态圈。最上层的是各肿瘤学研究实验室和全球性的药企以及政策法规的制定者(如FDA、CFDA);居于中间的是各种检测方案提供商或检测项目的服务商,包括了第三方检测机构、试剂盒开发商等等;终端用户是医院病理科及各相关科室。政府的专业机构制定政策及法规;超大药企(或制药公司与实验室合作)根据各自的药物决定具体伴随检测的种类与项目;终端病患是靶向药物和配套的伴随检测的受益者。居于中间的服务商直接决定了药企到病患的传递效率。
居于中间环节的部分是中国企业可以着重发力的地方,这也是数字PCR技术发展至今最明确的商业级应用领域,更是一部分企业赶超传统行业的机会所在:荧光定量PCR技术造就了达安基因、厦门艾德、匹基生物(后被QIAGEN收购)这样的龙头企业;NGS技术的成熟雨后春笋般地催生了贝瑞和康为代表的一批公司,目前还处于中原逐鹿的阶段;那么在数字PCR的液态活检市场中谁会脱颖而出呢?
数字PCR的历史进程
2003年,Kinzler和Vogelstein设计了一个称之为“BEAMing”进阶版步骤,它依赖于“珠子、乳化、扩增和磁力吸附”。BEAMing替代了手工在微孔板中进行样品离散,将每个油包水乳化的小滴变成了反应容器。通过使用目前广泛用于下一代DNA测序文库制备中的乳化PCR过程,BEAMing将模板、引物、PCR试剂和磁珠的混合物分至小滴中,其中大多数的小滴不含有或只含有一个模板。PCR完成后,其中扩增产物会通过生物素——链酶亲和素的键合关联在磁珠上,乳化物随之会被打散,珠子就能通过与检测寡核苷酸和流式细胞仪的杂交物所读取。
基于液滴的策略也被Bio-Rad实验室和RainDance科技公司进行了商业化。不同于磁珠,这两家公司都将PCR混合物离散(又或是如RainDance的董事长和首席执行官S. RoopomBanerjee所说的“液滴化”)成了2万个纳升大小(Bio-Rad公司的QX200)或者1千万个皮升大小的(RainDance公司的RainDrop)液滴。PCR扩增结束后,反应结果就可以通过荧光散射源和检测器来读取液滴,就像除去细胞之外的流式细胞仪(下面两篇文章将会为大家介绍Bio-Rad和RainDance公司的dPCR)。
数字PCR技术不断发展,Bio-Rad(油包水液滴式)、RainDance(油包水液滴式)、LIFETechnologies(芯片式)及Fluidigm(芯片式)等厂家相继推出技术较为成熟的数字PCR产品。
数字PCR的技术和原理
数字PCR是一种核酸检测和绝对定量的新方法。同传统PCR以及qPCR相比,数字PCR增加了一步分液(partitioning)的操作,将几十微升的已经配好的包含有引物、模板、buffer、酶等组分的PCR反应体系分隔成了众多微小的、独立的反应体系,这样能够直接数出DNA分子的个数,对起始样品绝对定量,通过将一个样本分成几万到几百万份,分配到不同的反应单元,每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子( DNA 模板) ,在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增,扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。如下图:
在分配的过程中,引物、酶等组分过量,而模板则是不过量的。模板DNA分子随机地进入到各个小的反应体系中,经过PCR扩增后,包含模板的体系完成扩增,不包含模板的体系无扩增。模板DNA分子进入各个小的反应体系的过程满足泊松分布规律,因此,检测扩增PCR产物的信号强度,带入泊松分布公式计算,即可计算出起始模板DNA分子的拷贝数。
目前数字PCR有两种分配技术:
1. 芯片式:
2. 油包水液滴式
值得注意的是,在DNA模板被分配的过程中,DNA模板分子数和分配系统的能力有密切的关系。假设DNA模板是 2000copy,要被分配到1000个小的反应体系中。那么会出现如下的情况:
即每个小反应体系中,DNA模板不同,经40轮PCR扩增后,凡是包含模板的小反应体系PCR扩增均能进入平台期。因此,对于dPCR反应来说,模板起始分子数与分配系统个数存在密切关系,不能过饱和。在不饱和的情况下,无模板的无扩增的反应体系个数带入泊松分布公式计算,推出起始DNA模板分子数。
(讲解分析部分):分子混合物被离散或分隔化到大量的反应室中(越多越好),这样每个室中平均有一个或零个目标核苷酸。对每个区划进行PCR反应后,使用泊松统计将阳性信号的计数转换为一个绝对值。如果将这一过程比作桑格测序(Sanger测序)。在单个管中对100个模板分子的混合物(其中有一个是突变的)进行测序会产生一个电泳图谱,其中在突变位点上的显著信号会是野生型碱基。你甚至基本不会发现,在(信号峰)下存在着一个表示不同碱基读取的小突起,因为它在整个分子混合物中的占比太低了。但将这些分子稀释并将其分布在多重反应中,就能产生出99个野生型信号和一个明显的突变信号,这就是数字的、绝对定量的结果,也是dPCR最大的优势之处。(优于NGS的原因吧)
超强的泊松统计
由于dPCR是一种终端分析法,如果目标分子没有很好的离散化,如一些小室在结束时具有不止一个的靶标(比如说在一个液滴中同时出现了几种突变的靶标,列如 KRAS、EGFR、BRAF和TP53等),那么理论上结果得到的浓度可能就会弃之不用。这就是泊松统计发挥作用的地方。据Bio-Rad实验室数字生物学中心科学事务部主任GeorgeKarlin-Neumann称,泊松统计描述了一种随机分布。只要小室没有达到饱和,用户就可以反算他们起始的分子数,即使一些孔中实际上容纳了不止一个分子(这种情况在数字PCR中读做单一计数)。只要你告诉我你有多少小室或者多少液滴,(并且)它们中多大比例呈阴性。它就会基本上告诉我初始的浓度,这也将告诉我阳性小室与阴性小室的比例。
劳伦斯利弗莫尔国家实验室医疗诊断项目负责人ReginaldBeer在研究生时发表了第一篇在单分散性(也就是说大小一致)液滴中进行数字PCR的报道。他说基于液滴方法的优势在于其可扩大性:增加反应容器的数量相对来说很简单,这样数据的质量也就随之增大。当你扩大或增加了反应容器的数量时,泊松精度也就大大提升了。
dPCR的优缺点(个人观点)
主要优点:灵敏度高(可达0.001~0.0001%),特异性高,可检测复杂背景下的靶标序列;可高度耐受PCR反应抑制剂(SDS、EDTA、Heparin(肝素,血液抗凝剂));不必依赖对照品或标准品,可对目标拷贝数直接进行精确的鉴定,分析微小的浓度差异;实验数据分析便捷,每个微滴的检测结果以阴性、阳性判读,数据分析自动化;可统计突变率,通过统计分析可得出靶点的突变率。
主要缺点:数字PCR仪通量较低(针对一管最高达10重反应),目前通常能检测的信号为VIC、FAM和HEX。一般单个反应2重反应效果最佳;数字PCR优点是灵敏度高,但是对于DNA浓度大的样本处理就没有优势,而且核酸浓度高时,每个微滴里面包含的拷贝数不符合泊松分布;数字PCR虽然不依赖标准曲线,但是每次反应之间存在差异,短期内不能代替qPCR,也不能代替其他金标准而作为首选方法。QX200、RainDance等数字PCR仪目前仅用于科研用途,数字PCR走向临床检验还需要一段时间。
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