新生小鼠大脑前额叶皮质神经元初级纤毛的脑保护功能

    孕期外界环境各种刺激可能引起胚胎大脑发育的多种关键信号通路功能紊乱，最终导致神经系统发育异常或者智力障碍。酒精和麻醉药物暴露是常见的两种外界刺激因素，易引发孕期应激状态，诱使发育大脑中神经细胞凋亡，最终导致神经系统功能障碍。当暴露在应激环境中时，发育大脑可能激活内源性脑保护机制，但目前对于该类保护机制的了解十分有限。

    初级纤毛是一类以微管为基础结构的细胞器,其来源于细胞的母中心粒,是锚定在细胞膜表面的突起结构。作为细胞感受器,初级纤毛从环境中接收各种信号,传导至细胞内引起细胞反应。前期研究表明,初级纤毛在与早期大脑发育密切相关，可以调控Wnt、Shh等信号通路转导作用。纤毛结构、功能异常可能与自闭症、癫痫等神经精神类疾病相关。因此在本研究，研究者探索当发育大脑受到外界环境刺激后，脑中的纤毛是否参与了脑保护的作用以及参与的相关机制。

    为观察发育大脑皮质中，锥体神经元初级纤毛结构异常时的表型变化，研究者将Ift88fl/fl小鼠与Emx1-Cre小鼠进行杂交，获得纤毛形成异常的条件敲除组（cKO）和纤毛结构正常的杂合子组（cHet，本研究中该组为对照）。

    研究者对P7小鼠（与人类孕晚期胚胎大脑发育阶段相近）使用2.5g/kg剂量的乙醇或PBS前后间隔两小时进行皮下注射。在注射后24小时，观察cKO和cHet两组小鼠的大脑皮质，发现在注射乙醇后24h，cKO组小鼠皮质中的Cleaved Caspase-3（CC3，激活状态的Caspase-3）表达量比cHet组显著增加，第V层尤为明显（图1D-F）。然而以上凋亡现象并未在注射PBS溶液后出现。

    相似的现象也在P7小鼠单次注射氯胺酮（20mg/kg）后出现。即在氯胺酮注射后24h，cKO组CC3阳性的细胞数量多于cHet组（图1G-I）。以上结果推测，在应激环境下，初级纤毛参与了发育期大脑的脑保护作用。

▲ Fig.1 A：验证Ift88fl/fl小鼠与Emx1-Cre小鼠杂交后，cKO组皮质神经元中的纤毛缺失，而cHet组纤毛结构仍然存在；B：构建的条件敲除鼠模型并不影响中间神经元的纤毛结构；C: 实验流程图例；D-E：P7小鼠在给予皮下注射乙醇24h之后，CC3表达增加，尤其在皮质第V层锥体神经元，而PBS注射组无影响。G-I：P7小鼠在给予氯胺酮皮下注射后24h，CC3表达增加。

    在本研究第一部分中，初级纤毛缺失后，给予外界刺激后皮质锥体神经元中CC3表达增加，在皮质第V层中尤为显著。因此研究者通过神经元各类亚型的标志物进行标记观察，但发现神经元不同类型并无数量差异（图2B），而是在神经元的树突数量、分支、长度等方面出现树突复杂度降低萎缩趋势（图2C-2F）。

    前人研究曾报道Caspases家族不仅与细胞凋亡相关，也可通过切割不同目的蛋白与其他非凋亡的生理病理事件相关，例如树突轴突修剪和变性。本研究恰恰检测到了，在乙醇注射24h后，cKO组小鼠大脑皮质第II和V层中Caspase介导的细胞骨架蛋白切割片段增多（图2G-2K）。应激环境下，纤毛抑制了CC3的激活，保护神经元免受于caspase介导的树突修剪变性。

▲ Fig.2 A：实验流程示例图；B：Thy-YFP阳性细胞数量在四组之间并无差异；C：四组代表性锥体神经元形态；D-F：四组锥体神经元的树突数量、分支、树突长度之间有明显差异；G-K：Caspase介导的细胞骨架蛋白切割片段Fractin和Cleaved Tubulin在乙醇处理后的cKO组小鼠中显著增加。

    在Ift88fl/fl; Emx1-Cre条件性敲除鼠模型中，在大脑背侧区来源的兴奋性神经元和胶质细胞中初级纤结构都是异常缺失的。为确认纤毛缺失导致的Caspase激活是细胞自主性还是非自主性作用，研究者使用Ift88fl/fl小鼠与ER81-CreERT2; Ai 9小鼠进行杂交，通过他莫昔芬诱导，达到仅在第V层锥体神经元中敲除Ift88基因的效果 (图3B)。

    在以上构建的小鼠模型中，观察乙醇注射24h之后，与Ift88fl/+杂合子组小鼠相比较，Ift88fl/fl条件敲除组第V层神经元CC3被激活程度大幅上升(图3C)，但CC3阳性细胞并不都是第V层神经元，由此作者推测神经元初级纤毛缺陷不仅影响自身，同时可能以旁分泌等方式影响周边其他神经细胞。综上表明，纤毛的神经保护功能是以细胞自主性和非细胞自主性的方式同时存在的。

▲ Fig.3 A：实验流程示例图；B：验证Ift88fl/fl小鼠与ER81-CreERT2; Ai 9小鼠杂交后，他莫昔芬诱导后，在tdTomato表达的第V层锥体神经元中，Ift88fl/fl组小鼠皮质神经元中的纤毛缺失，而Ift88fl/+组纤毛结构仍然存在；C-E：四组小鼠大脑皮质第V层中CC3表达情况。

胰岛素样生长因子1受体（Insulin-like growth factor 1, IGF1）是通过使其受体IGF-1R磷酸化，从而启动下游PI3 kinase/Akt 信号通路级联，发挥脑保护作用。前人研究表明位于初级纤毛上的IGF-1R对配体刺激比没有位于纤毛上的IGF-1R更加敏感，因此研究者探究在应激环境下，IGF-1R信号通路的脑保护作用是否需要初级纤毛参与。在P7小鼠进行乙醇注射之后，免疫荧光染色结果表明在应激环境下，pIGF-1R在cHet 组中神经元的纤毛上有表达(图4 A-4C)，而在cKO组小鼠中却没有检测到pIGF-1R信号，这表明在应激环境下纤毛结构对IGF-1信号转导是非常关键的。

    紧接着，研究观察了在应激环境下，IGF1信号通路下游Akt信号通路的情况。在给予了cKO组小鼠Akt特异性的激动剂SC79后，应激环境刺激下，cKO小鼠大脑皮质中第II和V 层神经元CC3表达明显减少 (图4 E–4G)，神经元树突明显萎缩的情况在使用了SC79之后也并未出现(图4 H–4L)。以上结果说明，在应激环境下，纤毛上的IGF-1R和下游Akt信号通路对皮质神经元的纤毛行使脑保护作用十分必要。 

▲ Fig.4 A-C：在应激环境下，初级纤毛上检测到了pIGF-1R；D：实验流程示例图；E-G：给予SC79后，在应激下四组CC3表达情况；H-L：给予SC79后，四组树突复杂度统计情况；M：研究机制图。

    本研究发现初级纤毛在受到药物、酒精等外界刺激时，能缓和发育大脑中的细胞应激反应，并提示遗传因素导致纤毛异常形成的患者，即使外界微小的刺激，也可能使大脑异常发育的风险增加，最终导致神经精神类疾病的发生。