FISH技术方法

2021
01/29

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FISH技术方法


荧光原位杂交技术fluorescence in situ hybridization),简称FISH。是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交,通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号,来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布,或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。

FISH广泛应用于各领域,尤其是基因和细胞领域,随着科技的迅速发展,FISH探针标记物越来越多,不仅从单一荧光发展到多色荧光检测,而且应用范围也进一步扩大,不仅可以用于分裂相细胞而且可以用于间期细胞检测,为FISH技术的临床应用打下了坚实的基础,下面介绍下它的发展历程

1969年,PardueJohn等两个研究小组开始采用放射性标记DNA28S RNA发明了原位杂交技术(FISH)。尽管当时原位杂交技术已经具有较高的特异性和灵敏度,但鉴于放射性同位素自身特性的局限,如安全性、空间分辨率低、不稳定性等问题,这项技术仅限于实验室研究方面的应用。

1986年科研工作者开始利用异硫氰酸盐荧光素来标记探针,并在荧光显微镜下进行观察分析,建立了荧光原位杂交技术。

1989年,Delong首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。由于FISH技术具有敏感度高、信号强、背景低、快速等优点,该方法在环境微生物的检测中得到了广泛的应用。

下面介绍下如何操作FISH实验的以及各种试剂的配制(绝对干货):

 实验目的

通过荧光原位杂交实验,辅助临床医疗诊断:

对肿瘤确诊病人评估预后及中位生存期、无病痛生存期(Dsease-Free Srvival,DFS),指导用药及治疗方案(针对乳腺癌、胃癌患者的HER-2基因诊断,针对CML患者的bcr/abl融合基因诊断等)。

 实验原理

利用DNA碱基对的互补性,将直接标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的目标样本的DNA(玻片上的标本)杂交,通过观察荧光信号在染色体上的位置反映相应染色体的情况

 仪器设备及耗材

(一) 仪器设备

①:全自动分子杂交仪

②:荧光显微镜及分析软件

③:恒温水浴箱3个以上(小型号)

④:冰箱2台(提供试剂和标本存放, 4摄氏度和-20摄氏度)

⑤:离心机(用于羊水标本以及血液标本,绒毛标本处理过程的离心)

⑥:通风橱(配固定液,等操作)

⑦:迷你离心机(探针,缓冲液的离心。可离1.5ml管、0.2ml管)

⑧:考普林瓶15个(FISH实验中盛放各种试剂,溶液)

⑨:移液枪(5ml1000ul200ul10ul)放于杂交室和制备室。

10:震荡混匀器

11:计时器,温度计,温度湿度显示器。

12:载玻片盒(用于存放已经FISH实验后的FISH片子)

13:洗耳球,吸量管(10ml,烧杯,容量瓶,电子天平,常用天平称。

(二) 耗材:载玻片(最好,带磨砂的,写用铅笔患者编号,因为不带磨砂的贴标签会被乙醇洗掉。)

大盖玻片(方形,用于镜检)

小盖玻片(方形或圆形,圆形佳,用于分子杂交时候封片) 离心管(10ml1.5ml200ul 3ml一次性吸管

个人防护用品,标签纸等。

(三)各种溶液的配制

2.1NaOH溶液:

a) 用天平称取4克分析纯的NaOH固体,置于一只三角烧瓶中。

b) 200ml量筒准确取100ml蒸馏水,缓缓注入盛放NaOH固体的三角烧瓶中。

c) 摇荡三角烧瓶使NaOH固体充分溶解。

d) 然后缓缓倾倒入250ml广口瓶中,密封保存备用。

2.2 配制20XSSC溶液:

取氯化钠175.5g和柠檬酸三钠88.2g,加入1000ml双蒸水中,用磁力搅拌棒搅拌,使其完全溶解,用滤纸过滤,调pH5.3,封口膜封好,4℃保存备用,有效期6个月。

2.3配制2XSSC溶液:

20×SSC和双蒸水,按1:9的比例稀释,调pH7.0, 封口膜封好,4℃保存备用,有效期6个月。

2.42×SSC/0.1%NP-40配制 50ml 

20×SSC(pH 5.3) 0.5ml NP-40 449.5ml 双蒸水 500ml pH7.0 ,封口膜封好,室温保存备用,有效期6个月。

2.5系列酒精的配制:

取无水乙醇28ml34ml,分别与12ml6ml双蒸水混合,配成70%85%的酒精,与无水乙醇共同组成70%85%100%的系列酒精,封口膜封好,室温保存备用;另配制一上述系列酒精,封口膜封好,-20℃室温保存备用。

2.6PBS缓冲液:

PBS 1L配方(pH7.4):磷酸二氢钾(KH2PO4)0.27g 磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.42g 氯化钠(NaCl)8g 氯化钾(KCl)0.2g 加去离子水约800mL充分搅拌溶解,然后加入浓盐酸调pH7.4,最后定容到1L。高温高压灭菌后室温保存。

2.70.075M Kcl低渗液:

5.59g加入1000ml去离子水中溶解(或Kcl 2.794g溶入500ml去离子水中),备用,4摄氏度低温保存。

2.8固定液:

按甲醇(AR):冰乙酸(AR)=3:1的比例配制细胞固定液,细胞固定液现配现用。

2.9:1M Hcl

.9mlHcl加去离子到100ml混匀,4℃保存备用。保存1个月。

2.100.08mg/ml胃蛋白酶工作液:

A:取40mg胃蛋白酶,放入1.5MLEP管中,加1ml去离子水溶解,分装到10200ul离心管中。 B:次使用时,在考普林瓶中加50ml去离子水,加入500ul1M Hcl,加入一管分装的胃蛋白酶溶液(100ul)。

2.11:200ug/mlPK工作液:

a PK储存液(20mg/ml):称取0.1g蛋白酶K干粉溶于2XSSCPH=7.0)溶液中,轻轻摇动,直至PK完全溶解,不要漩涡混匀。-20℃保存。 b 蛋白酶K工作液(200ug/ml):取0.4mlPK储存液溶于40ml2XSSCPH7.0)溶液中。

 实验步骤

(一):羊水样本FISH实验SOP

一:标本预处理

①:将新鲜收集到的羊水(10ml)细胞1500rpm离心8min。(转速可调至15002000范围内)。

②:去上清,加入5ml0.075M kcl低渗液。混匀,后放入37℃水浴30min。(作用:利用渗透压差使细胞膜破裂,细胞核吸水膨胀。利于探针的杂交。)

③:加入2ml固定液预固定,(甲醇:冰乙酸=3:1),混合均匀后1500rpm离心8min(固定液中主要利用冰乙酸和甲醇的小分子性,有极强的细胞穿透能力,在瞬间杀死细胞,使细胞固定在低渗后的膨胀状态,保证细胞中需要检测的物质不被破坏。)

④:去上清,加入5ml固定液固定,混合均匀后1500rpm离心8min

⑤:去上清,加入5ml固定液,混匀后于-20℃保存。

二:样本处理:

①:取出预固定好的羊水标本,1500rpm离心8min。去上清,加适量固定液(10ml的羊水样本,根据细胞的多少,一般留1ML左右的固定液),

②:吹打混匀后吸取少量细胞固定液滴片(滴片前一定要将细胞吹打散开,滴片时保证细胞均匀散开,不要太密集,也要保证有足够计数的细胞)。自然晾干,56℃烤片30min。(防止掉片)

③:将上步所得玻片置于372XSSC溶液中浸泡10min(洗涤玻片,增加细胞核的通透性,模拟细胞的生理环境,保证细胞被检测物质的稳定性。)

④:将玻片置于3740ml胃蛋白酶工作液中15min。(消化细胞中的各种蛋白,增加组织通透性,便于探针杂交)。 ⑤:室温下将玻片于70%95%乙醇中各脱水2min(梯度脱水)。自然干燥玻片,

三:变性,杂交:

①:室温(暗室)下按探针:缓冲液=2:8的比例配制探针混合物,放入200ul EP管中,充分混匀,离心1-3S.

②:将10ul探针混合物滴于玻片杂交区域,立即盖上盖玻片,用封片胶封片(保证杂交环境湿润状态。

③准备杂交仪,755min变性,4216h杂交过夜。(杂交仪使用前添加去离子水到保湿材料上。)

等二天: ①:用镊子取下封片胶和盖玻片。(如果盖玻片不好下,可以先在2XSSC中浸泡下再去掉)。

②:玻片洗涤(暗室环境)。将玻片于482XSSC溶液中震荡1-3S,漂洗8minDOUBLE

③:于480.1%NP-40/2XSSC中漂洗5min。室温下于70%95%乙醇中脱水各3min。晾干。(NP-40(乙基苯基聚乙二醇)是一种裂解液,去垢剂,非离子表面活性剂,根据浓度不同,作用不同,可以看作是聚乙二醇(PEG)的衍生物,1%浓度时能很好地消化细胞膜,但对核膜没有影响,作裂解液时是一种温和的裂解液,(相对于阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)而言。)

④:复染:将15ulDAPI加入杂交区(DAPI是一种细胞核染料,能够使细胞核在激发光激发下发出蓝色荧光),盖上盖玻片,20min后于荧光显微镜下观察。

备注:

加探针后所有操作均应该在暗室环境下。

杂交温度的选择。在37-45℃均可进行,选择42℃是因为37℃时杂交灵敏度高,但太多非特异性杂交。45℃杂交特异性高,但灵敏度降低。选择中间42℃比较适宜。

FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。温度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率;光照影响了荧光染料的强度;各种试剂pH是否符合要求直接关系到FISH的稳定性。所以同样的样本及探针在冬天更应该注意温度的控制,或者适当延长浸泡洗涤及消化时间。

直标型探针和间标型探针有何不同?为什么我们要选择直标型探针?所谓的直标型探针是指DNA探针共价连接着荧光素基团;间标型探针则是指DNA探针先与某个半抗原连接,诸如生物素或地高辛,然后半抗原与荧光素基团连接从而形成探针-半抗原-荧光素基团,类似三明治的复合物。与间标型探针相比,直标型探针具有低背景、高特异性的特点。

在多数情况下,如果FISH操作没有得到正常的结果,我们可以将探针洗去,然后使用同样的探针进行再次的杂交。

f 0.1%NP-40/2XSSC洗涤非特异性杂交信号时,也洗掉没有杂交上的探针。

用于实验的2 X SSC.01NP-40/2 X SSC洗液、胃蛋白酶工作液、0.01M Hcl、固定液、酸性亚硫酸钠和蛋白酶K工作液不可反复使用。

(二):血液样本FISH实验SOP

一:样本预处理:

①用移液器取取2ml血液(抗凝血)(最好24小时内处理)(血液样本根据检测项目的不同,病灶部位的不同,临床医生抽取患者不同部位的血,如:检测MM:抽取骨髓血,检测CML(慢性粒细胞白血病),抽取外周血。加入10ml离心管中,加入5mlPBS缓冲液,洗涤,1500rpm离心8min。(在模拟细胞生理环境下对细胞进行洗涤。)

②:去上清。加入5ml低渗液,37℃孵育20min,期间吹打细胞2-3次。(使红细胞破裂)

③:加入2ml固定液,预固定,1500rpm离心8min

④:去上清加入固定液,反复固定、离心至固定液颜色由深变浅。-20℃保存。

二:样本处理:

①:将细胞固定液1500rpm 8min。去上清,加入适量固定液,滴片。

②:自然晾干,5630min烤片。

③:于37℃下2XSSC中洗涤20-30min。于胃蛋白酶工作液中洗涤8min2XSSC中洗涤5min 2次。

④:(暗室)探针:缓冲液=2:8,加探针于杂交区,盖片,封边。

⑤:78℃变性5min4216 h杂交过夜。

等二天(暗室): ①用镊子取下封片胶和盖玻片。(如果盖玻片不好下,可以先在2XSSC中浸泡下再去掉)。

②玻片洗涤(暗室环境)。将玻片于482XSSC溶液中震荡1-3S,漂洗8minDOUBLE

③于480.1%NP-40/2XSSC中漂洗5min。室温下于70%95%乙醇中脱水各3min

④甩干后自然晾干玻片,向杂交区加入15ulDAPI,盖上大盖玻片,(DAPI是一种细胞核染料,能够使细胞核在激发光激发下发出蓝色荧光),盖上盖玻片,20min后于荧光显微镜下观察。

(三):石蜡组织样本FISH实验SOP

一:样本预处理:

 将组织切片置于65℃下过夜烘烤,老化玻片。

②将组织切片浸泡于二甲苯中室温脱蜡2次,每次10min。(或置于一瓶二甲苯中脱蜡 20-30min)。随后浸入100%乙醇中5min。(无水乙醇洗涤二甲苯)。

③:将组织切片依次室温100%85%70%乙醇中各2min(梯度复水)。

④:将切片放入去离子水中90℃孵育30min。(或者:50℃下用30%[w/v] 酸性亚硫酸钠(sodium bisulfite )处理组织切片2030分钟。)(去除核酸表面的蛋白质,增加组织的通透性,利于探针的杂交)。

⑤:取(3.2mgX3=9.6mg)胃蛋白酶加入40ml0.01M hcl得胃蛋白酶工作液。37℃孵育25-30min。(亦可用200ug/mlPK10min代替,PK工作液的时间短,但容易消化过度。)

⑥:于2XSSC溶液中漂洗2次,每次5min

⑦:将漂洗完的玻片浸入放有2.5%甲醛的PBS缓冲液中(1ml甲醛加入39mlPBS缓冲液中)中10min*此步骤可以省略,不影响信号质量,而且甲醛为高毒性物质。故一般不用。)。

⑧:将玻片一次置于70%95%乙醇中各2min,自然晾干玻片。

⑨:按探针:缓冲液=2:8配探针混合物,将10ul探针混合物滴于玻片杂交区域,加盖小玻片,封片。于杂交仪上82℃变性5min,杂交过夜。

二:洗片: ①:去掉封片胶和盖玻片,于46℃(46-48℃)水浴2XSSC溶液中5minDouble

②:将玻片置于460.1%NP-40/2XSSC中,晃动1-3S5min后取出。

③:70%95%乙醇中脱水各2min

④:甩干,自然干燥。

⑤甩干后自然晾干玻片,向杂交区加入15ulDAPI,盖上大盖玻片,(DAPI是一种细胞核染料,能够使细胞核在激发光激发下发出蓝色荧光),盖上盖玻片,20min后于荧光显微镜下观察。

备注冬季脱蜡时间延长, b 根据切割组织样本的厚度不同,以及样本组织的不同,消化时间适当增减。

本文由作者自行上传,并且作者对本文图文涉及知识产权负全部责任。如有侵权请及时联系(邮箱:nanxingjun@hmkx.cn
关键词:
FISH,胃蛋白酶,细胞核,方法,技术,乙醇

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