核酸知识系列（三）

DNA的提取方法有多种，市场常使用Qiagen的提取试剂盒进行提取，关于Qiagen提取试剂及原理，进行简单的介绍：

ProteaseK：蛋白酶，消化缠绕在DNA上的组蛋白等之类的东西；

BufferAL：含有高浓度的盐酸胍的裂解液，裂解白细胞和红细胞，盐酸胍是强的蛋白变性剂，也可以使缠绕在DNA上的蛋白变性，将纯的DNA释放出来。同时提供高盐离子环境，促使DNA特异性的吸附到硅胶膜上；

加乙醇的目的：破坏溶液中的DNA分子表面的水化层，有利于DNA吸附到硅胶膜上；

Buffer AW1：含高浓度的盐酸胍和氯化钠，洗掉硅胶膜上非特异性结合的蛋白；

Buffer AW2：成分基本是Tris-Hcl、水和乙醇，作用：洗掉硅胶膜上残留的盐酸胍、氯化钠等盐离子；

Buffer AE：10mM Tris-HCL（pH9.0）与1mM EDTA作用，将硅胶膜上吸附的DNA洗脱下来。

DNA检测：用NanoDrop 2000（或更新的产品）测定DNA溶液的OD值，并计算OD260/OD280、OD260/OD230的比值，确定其纯度及浓度：

OD260/OD280为1.8~2.0（一般在1.8左右），当OD260/OD280>2.0时，表明RNA含量过高，当OD260/OD280<1.8时，表明蛋白质含量过高（含有蛋白质或酚类污染）；

OD260/OD230应>2.0，OD260/OD230<2.0说明去盐不充分，可用70%乙醇洗涤；

DNA浓度可用NanoDrop或Qubit进行测量；

DNA的完整性可用1%的琼脂糖凝胶电泳或Agilent 2100进行检测。

RNA的提取条件较DNA要求严格。RNA由于自身结构和RNA酶的存在，极易降解。RNA酶是导致RNA降解的主要物质，RNA酶广泛存在人的皮肤和环境中，此酶非常稳定，常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的RNase完全失活。

经高压灭菌的一次性使用的塑料制品如试管和离心管等基本上无RNase，可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。实验室用的普通玻璃器皿经常有RNase污染，使用前必须于180℃干烤8h以上，或用0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯、试管和其他用品。DEPC是RNase的强烈抑制剂。同时需要注意的是：DEPC具体致癌性，操作时必须小心。

常用的RNA提取方法，有TRIzol试剂，苯酚，异硫氰酸胍-酚法等：

TRIzol法是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，氯仿离心，异丙醇沉淀RNA。

苯酚法，将细胞置于十二烷基磺酸钠（SDS）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，剧烈震荡，离心形成上层水相和下层酚相，核酸溶于水相。

异硫氰酸胍-酚法：用过异硫氰酸胍与β-疏基乙醇共同作用抑制RNase的活性。异硫氰酸胍与十二烷基肌氨酸钠作用使蛋白变性，释放RNA，在酸性条件下，DNA同蛋白质一起离心下来，RNA溶在上清中，该方法提取RNA纯度高，完整性好，适合纯化mRNA，逆转录和文库构建。

还有一些试剂盒，如RNA plant plus植物总RNA提取试剂盒（TIANGEN），总RNA提取试剂盒（Qiagen），总RNA提取试剂盒（Promega），使用简单、快速、高效，均能获得满意结果。

RNA检测：用NanoDrop2000（或更新的产品）测定RNA溶液的OD值，并计算OD260/OD280、OD260/OD230的比值，确定其纯度及浓度：

OD260/OD280为1.8~2.2（一般在2.0左右），当 OD260/OD280<1.8时，溶液中蛋白或者其他有机物的污染比较明显，当 OD260/OD280>2.2时，说明 RNA 已经水解成单核酸了；

OD260/OD230也可表明 RNA 的纯度，OD260/OD230应>2.0，OD260/OD230 <2.0 说明去盐不充分，需用70%乙醇沉淀 RNA；

RNA浓度可用NanoDrop或Qubit进行测量；

RNA的完整性可用1%的琼脂糖凝胶电泳或Agilent 2100进行检测。

RNA样品质量用Agilent 2100生物分析仪检测，总RNA的完整性主要通过RNA完整度（RNA integrity number，RIN）来体现。一般情况下，RIN值大于8即表示RNA的完整性较高。