「肺」你莫属,乘风破浪的RET学习笔记(一)下

2021
01/27

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衡道病理
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上海瑞金医院

主治医师 硕士

陈晓炎


第三部分 分子分型


  • 分子图谱已经改变了对肺癌的分类和治疗策略;

  • 对于晚期NSCLC初诊时即需要进行驱动基因检测以确定分子分型,从而采用相应的靶向药物治疗,对于驱动基因阴性的患者,需要进行PD-L1检测,以指导免疫治疗;

  • 近10年来,NCCN不断更新肺癌生物标志物,越来越多的罕见靶点被推荐。

 


  • 2020 v1 版NCCN指南:

    分子检测需要在第一时间满足治疗需求;

    必检项目:EGFR,ALK,ROS1,BRAF,PD-L1;

    可检项目:MET,RET,HER2,TMB;

    NCCN指南推荐广泛多基因平行检测,最大化罕见驱动基因的检出率,为患者提供可及的靶向药物。


  • 2020 CSCO非小细胞肺癌指南:推荐罕见驱动基因检测

 


  • 越来越多的生物标志物具有获批的治疗药物

 


一、EGFR

EGFR引发的精准诊疗革命——治疗获益大幅提升


1、精准诊疗带我们在EGFR突变人群走过的历程:

  • 不经选择化疗患者→根据体征选择优势人群→携带可靶治疗变异的患者→接受克服耐药治疗的患者;

  • 药物的引进也推进了检测的进展。


2、EGFR突变的检测方法:

  • 从传统的Sanger测序到ARMS,DDPCR,NGS:随着检测技术的发展,敏感性越来越高,需要的样本量也减少,甚至细胞或液体标本也可以进行检测。


3、突变频率:

 


  • EGFR突变中93%出现在18-21号外显子,超过80%为Del19及L858R;

  • 罕见突变17%,主要包括18外显子上的G719X,E709X,Del18,19外显子上的ins19,20号外显子上的ins20,S7681,21号外显子L861Q。


4、检测技术:

  • NGS更全面更精准呈现肺癌患者EGFR基因突变特征:

    ARMS方法检测EGFR 29种基因突变,其中19del突变类型仅19个,而燃石数据库NGS检测测得44种EGFR 19 del亚型。


5、罕见突变:

(1)NCCN指南关于EGFR罕见突变推荐:

  • 不仅要检测常见突变,也要检测少见突变,EGFR少见突变约占EGFR突变的10%,如:Exon19ins,L861Q,G719X,S768I,这些突变同样对TKI治疗敏感;

  • Exon20插入突变中除A763-Y764insFQEA突变对TKI治疗敏感外,大多数Exon20插入突变可预测TKI耐药。


(2)EGFR罕见突变的特征:

  • 一项研究中,1837例EGFR突变样本中,218个样本(11.9%)为罕见突变,其中男性患者(54.1% vs. 44.4%,P=0.007)和吸烟患者(30.7% vs. 24.3%。P=0.039)出现罕见EGFR突变的几率高于常见突变;

  • 罕见突变的总体分布情况:G719X 21%,20INS 31%,T790M 14%,Complex L858R 17%,其他17%。


(3)检测罕见突变的必要性:

  • EGFR不同变异位点对TKI的疗效反应有差异,常见突变位点之间,不同药物之间疗效也不尽相同,少见突变如Exon20插入突变中A763-Y764insFQEA突变对TKI治疗敏感,其余Exon20插入突变对TKI耐药,因此需要深入识别变异位点,实现精准治疗。

  • EGFR TKI对Exon18突变的敏感性:不同突变位点对一代、二代及三代TKI敏感性不同。

    少见突变Del18,E709K和G719A对一代和三代TKI的敏感性不如Del19,三者中Del18更差;

    E709K和G719A对TKI的IC90相近,对一代TKI有一定的敏感性;

    Del18,E709K和G719A对二代TKI更敏感。

  • EGFR 20号外显子不同插入变异体对EGFR-TKI的反应不同:

    EGFR 20号外显子插入突变是EGFR突变的第三大类型,多发生于C螺旋之后的Met766-Cys775,少数位于C螺旋的Glu762-Tyr764.

    20号外显子前端插入对TKI敏感,后端插入对TKI耐药。A763-Y764insFQEA的患者可以考虑使用TKI治疗,其他位点则不适合TKI治疗。


6、EGFR融合:

  • EGFR融合为肺癌新的治疗靶点

  • 一项研究显示,5例转移性肺癌患者,采用 FoundationOne® 进行基因检测,结果他们的肿瘤都具有EGFR融合(EGFR-RAD51和EGFR-PURB)。其中4人接受EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)治疗有应答。


7、耐药:

  • EGFR突变晚期NSCLC患者靶向治疗后不可避免会发生耐药。

  • 耐药机制:

    一代/二代EGFR-TKIs获得性耐药机制主要是20号外显子T790M突变;

    三代EGFR-TKIs一线治疗获得性耐药机制包括:EGFR突变(如L718Q、C797S),旁路激活(如MET扩增,HER2扩增)等。

    因此,对于EGFR-TKIs耐药的患者需要再次活检明确耐药机制,以指导后续治疗。

    NGS助力发现EGFR TKI原发与获得性耐药机制:

  • 当EGFR突变伴发TP53突变,HER2扩增,MET扩增时,TKI疗效差,因此,FoundationOne® CDx 可帮助识别EGFR TKI有效治疗人群。


二、ALK:

1、ALK融合基因的发现及ALK融合阳性NSCLC治疗进展:

  • 2007年首次在非小细胞肺癌中发现EML4-ALK融合基因,并能独立成瘤;

  • 磷酸激酶区在各种ALK融合蛋白中稳定表达,使得抗ALK激酶抑制剂获得成功;

  • ALK融合基因阳性NSCLC靶向治疗日益成熟,给患者带来显著获益。

 


2、ALK应进行常规检测,各指南对于ALK检测的推荐:

 


3、检测方法:

  • 融合基因检测可以从DNA、RNA、蛋白层面进行,检测方法包括FISH、NGS、RT-PCR、IHC。

  • NPMA批准四种方法用于ALK融合的检测:

 


(1)基于DNA的荧光原位杂交(FISH)检测ALK重排---金标准

  • 原理:直接/间接标记了荧光的单链DNA(探针)与其互补的目标样本DNA(玻片上的标本)退火杂交,通过观察荧光信号在染色体上的位置反映相应染色体或DNA序列的情况。


  • 判读:

    雅培 Vysls ALK 分离探针试剂盒采用“分离”分析,基因倒位和ALK重排后,红色和绿色探针分开。

    样本中≥15%细胞红色和绿色信号分开或绿色信号缺失,判断为阳性,即为ALK基因相关易位。

    FISH假阴性的原因:ALK-EML4倒位融合后伴有不同位置或区段的缺失,而导致红点缺失或红绿都缺失等情况,导致不满足上述两类阳性信号类型的判读。

    当处于临界值附近、出现单绿信号、伴有扩增等不确定的情况时,建议使用其他技术平台复检。


  • FISH检测基因重排的优势和局限性:

    优势:

    分离信号直观可信;大部分病例容易判断。

    几乎没有假阳性;

    仍是融合基因判读的金标准。


    局限性:

    对操作和判读技术要求较高;

    少于50个肿瘤细胞进行判读有局限性;

    FISH判读接近cut off存在商榷之处;

    保存年份久/前处理欠佳的病例可能出现信号弱的倩况;

    异常信号特征的判断需要进一步验证;

    无法适用于大规模筛查。


(2)基于RNA的检测(RT-PCR):检测已知融合,未包含NSCLC中的罕见融合类型

  • 在非小细胞肺癌中已确定了几种EML4-ALK融合变异体,并证明其具有功能活性。

  • 转化需要ALK酪氨酸激酶的活性。

  • 越来越多的罕见融合类型被发现。


  • RT-PCR平台注意事项:

    仅能检测已知融合基因类型;

    检测环境及标本质量要求高;

    阈值附近样本需谨慎,必要时换平台复检。


(3)IHC-Ventana D5F3 平台注意事项:

  • 非腺癌病例判读需谨慎;

  • 富含钻液分泌的病例要格外留意阳性信号的部位及真假;

  • 排除已知的染色元素,包括:肺泡巨噬细胞、神经纤维及神经节细胞、呼吸道上皮细胞、坏死组织碎片及细胞外黏液吸附;

  • 标本的规范化处理,室内质控、室问质评尤为重要;

  • 结果不确定时,使用其他技术平台行进一步复检。


(4)NGS优势:

  • 能够检出特殊的、少见的融合类型,可区分融合类型,可发现新的融合。Non-EML4融合大约占1/4;至少有30余种不同的partner已被报道;

  • NGS可检测ALK耐药机制:包括ALK非依赖性与依赖性耐药机制。


ALK非依赖性的耐药机制:

  • 替代性致癌驱动基因:

    这一作用与EML4-ALK无关;

    已在ALK融合蛋白的上游和下游识别到替代性致癌驱动基因:KIT(扩增)、EGFR(突变和激活)、KRAS(突变和扩增)、IGF-1R(表达和激活)、IRS-1(表达)、MET(激活)、MEK(突变);

  • 组织学类型转化:如NSCLC转化为SCLC;


ALK依赖性的耐药机制(继发性耐药):

  • ALK激酶区突变,拷贝数增加;

  • 一代、二代ALK抑制剂继发性耐药突变的差异:

    一代TKI主要耐药突变:L1196M和G1269A;

    二代TKI主要耐药突变:G1202R;

    二代ALK抑制剂更多出现ALK耐药突变,达50-70%。


4、融合基因检测技术的优劣势:

 


ALK检测样本类型及检测策略优化推荐(中国非小细胞肺癌ALK检测临床实践专家共识):

  • ALK检测标本类型:

    检测标本优先使用肿瘤组织标本(强烈推荐);

    肿瘤组织标本不满足要求时,稚荐使用细胞学标本(推荐);

    对于少数客观上不能获得组织或细胞学标本的晚期肺癌患者,可尝试血液朋亩脊液检测(专家共识意见);

  • ALK检侧策略优化:

    目前,NMPA批准了4个技术平台的 ALK 基因检测随诊断试剂,包括 ALK Ventana -D5F3 IHC、FISH 、 RT-PCR、NGS检测平台。专家组强烈推荐这4种方法均可用于A LK基因融合检测;

    优先应用Ventana-D5F3 IHC进行ALK检测(强烈推荐);

    当和其他基因(如EGFR、ROSI 等)一起检测时,可以联合FISH和RT-PCR,或进行 RT-PCR 或NGS多基因检测(推荐)。


 ALK FISH vs IHC:临床疗效是金标准

  • ALK FISH(-)/IHC(+)可能原因:

    FISH假阴性(易位机制):ALKi 治疗有效;

    IHC假阳性(判读):ALKi 治疗无效;

  • ALK FISH(+)/IHC(-)可能原因:组织处理;IHC染色。


三、ROS1:

ROS1阳性NSCLC是NSCLC的独特分子亚型


1、ROS1阳性NSCLC的发现历程:

  • 2007年,首次发现NSCLC患者和细胞株中存在ROS1融合;

  • 2008年,发现ALK抑制剂TAE684和克唑替尼抑制ROS1融合NSCLC细胞株活性;

  • 2009年,克唑替尼PROFILE研究扩展了ROS1队列;

  • 2012年,证实克唑替尼对ROS1融合NSCLC患者有抗肿瘤活性,将ROS1阳性定义为特定亚型;

  • 2014年,PROFILE 1001 ROS1队列研究结果发表;

  • 2016年,亚裔OO 12-01研究结果发表。


2、ROS1阳性NSCLC存在多种融合类型:

  • ROS1总共有14种不同的融合伴侣;

  • CD74-ROS1融合型有更高的脑转移率;

  • 非CD74-ROS1融合型拥有更长的PFS和OS。


3、ROS1检测方法:

  • ROS1不同检测方法的比较:

 


  • ROS1重复序列对NGS检测的影响———假阴性

    (1)ROS1 NGS检测由于存在插入点重复序列,影响NGS分析时Mapping结果,可能导致假阴性;

    (2)ROS1基因断裂点不确定,不仅存在于32、34、35、36号外显-内含子区域,探针设计要求高。


  • ROS1重复序列对探针设计和检测的影响———假阳性

    融合基因插入点在ROS1重复序列,导致自动过滤失败,造成假阳性


  • ROS1检测:NGS与其他方法学比较

    一项研究中23 例 ROS1阳性样本:

    FISH:检测20例,2例阴性。融合伴侣基因与ROS1非常接近等原因可导致FISH结果假阴性。

    RNA based NGS:检测19例,3例阴性,质量控制(QC)不通过,影响检出率。

    DNA based NGS:检测18例,4例阴性。内含子测序覆盖困难,将导致DNA based NGS 无法检测到断裂点发生在未测序区域的ROSI重排。


  • DNA/RNA based NGS联合检测:

    MSK-IMPACT(DNA -based NGS)检测2502例肺腺癌标本,在276例阴性样本中取25例再进行RNA-Based NGS:36个样本被检测出融合,其中33个为actionable;11位患者接受靶向药治疗,8例患者获益。


四、BRAF基因变异:

1、BRAF突变:

  • 在NSCLC发生率约2-3 %;

  • 主要集中在11和15外显子,半数为15号外显子第600氨基酸变化(V600E),其次为11号外显子G469A及15号外显子D594G。


2、BRAF基因融合:

  • 在一项全基因组测序中,发现BRAF融合发生率0.2%;

  • BRAF融合突变发现在内含子9和10上,最常见融合体为AGK , DOCK4和TRIM24等。


3、BRAF抑制剂治疗BRAF突变型NSCLC:

  • BRAF-TKI达拉非尼+MEK-TKI曲美替尼的联合治疗是FDA批准的BRAF V600E突变NSCLC治疗方案,总有效率超60%,显著改善了患者生存。


五、MET:

1、指南推荐:

(1)MET 14外显子跳跃突变纳入2020年NCCN/CSCO指南,推荐常规检测

(2)MET扩增纳入2020年NCCN/CSCO指南关注范围

  • 在分子检测部分,NCCN指南建议对于EGFR-TKI耐药患者,如果没有检测到T790M,应该进行MET扩增复测。

  • 在分子分型部分,CSCO指南建议MET扩增应该作为常规检测(组织优先血液补充)。


2、MET14外显子跳跃突变:

(1)临床特征及发生率:

  • MET EX14m见于1-3% NSCLC

  • 在肺肉瘤样癌(PSC)中MET Ex14m+可高达31.8%

  • MET Ex14m+同时合并MET扩增:15-20%

  • MET Ex14m是NSCLC独立的驱动基因,通常与其他基因变异相互排斥,如EGFR、ALK、ROS1

  • MET 14外显子跳跃突变多见于高龄、男性、晚期NSCLC患者

(2)检测方法:

  • NGS和PCR为MET 14外显子跳跃突变的主要检测方法

  • MET 通路异常有多种检测方法,不同类型的MET改变检测方法不同

  • NGS和PCR检测MET 14 外显子跳跃突变的优缺点:

 


  • RNA 转录剪接缺陷对DNA based NGS检测的影响:

    MET exon 14 Skipping:体细胞MET基因剪切位点的突变会导致RNA水平MET基因14号外显子的沉默,被称为met14跳跃缺失。

    DNA水平检测MET exon 14 skipping会发生一定几率错检及漏检。

    RNA水平检测到13外显子与15外显子发生拼接,则可直观性判读发生MET 14外显子跳跃突变。

  • 组织样本中不同检测方法比较:


  • RT-PCR与Sanger测序比较:前者敏感性100.0%,特异性97.4%;后者敏感性61.5%,特异性100.0%。

  • RNA-based与DNA-based NGS比较:

    相比RNA-based的方法,利用DNA based的方法必须保证所有的突变类型都被检测出来,覆盖区域不够可能会导致漏检;

    DNA-NGS检测中,当引物未同时靶向13号内含子的39个剪接点和14号内含子的59个剪接点时,可能不能检测到肺癌中MET4外显子跳跃突变的发生,而RNA-NGS可能会检测到此类事件;

    NCCN指南推荐:分子检测部分,建议如果可能的话尽量采用大panel的二代NGS基因检测,如果内有检测到驱动基因,尤其对于非吸烟者,建议采用基于RNA为基础的NGS复测。


3、MET扩增:

(1)MET扩增是一代/二代EGFR-TKI耐药机制,但其发生率不同:

  • 初治患者中:约2-4%;

  • 一代、二代EGFR-TKI耐药患者中:约5-22%;

  • 一线奥希替尼耐药患者中:约15%;

  • 二线奥希替尼耐药患者中:约19%。

(2)检测方法:

  • FISH、NGS、数字PCR和IHC都可以用于检测MET扩增/过表达;

  • MET扩增是连续变量,如何找到可以使患者获益的阈值非常关键:

    MET扩增程度在自然人群中的分布是偏态分布的,扩增程度越高,人群越少;

  • MET扩增检测:FISH是组织检测金标准,但是FISH判读存在不同标准。

 


  • 研究显示,基于FISH检测,MET扩增越高,接受MET-TKI疗效越好

  • FISH与NGS比较:

    以FISH为参照,有限的数据表明组织NGS仅能测出1/2的MET扩增;

    以FISH为参照,组织NGS的特异性高,但敏感性仅为48%;

    相较于FISH,组织NGS能检测出大部分定点扩增,但多倍体被遗漏,可能是因为多倍体通常在NGS生信解读时被过滤了,未被报告。


六、HER2:

  • HER2在肺腺癌中的扩增频率是2-5%,HER2基因突变在肺腺癌出现的频率是2-3%,不过所有的突变都发生在第20号外显子上。以免疫组化检测的HER2蛋白高表达的比例为2-4%。

 


  • HER2基因突变与扩增相互独立发生;

  • HER2突变的NSCLC治疗:泛HER抑制剂,HER2 exon 20抑制剂,抗体-抗体药物耦合物。


七、RET:

1、发生率:RET融合在肺癌发生率约1-2%。


2、RET融合伴侣类型:

 


3、RET融合NSCLC患者的临床特征:

患者更年轻,不吸烟,拥有其他致癌性驱动基因的可能性更低,肿瘤细胞中印戒细胞比例≥10%,肿瘤体积更小,更早发生淋巴结转移,低分化。


4、检测方法:

(1)荧光原位杂交(FISH)是检测RET融合的金标准:

  • 主要优势:敏感性高,且与融合伴侣无关;

  • 主要缺点:费用高、需要专业的技术力量,仅能在大的中心进行,无法提供特殊RET融合伴侣的信息。


(2)RT-PCR目前应用于绝大多数的RET筛查研究中:

  • RT-PCR的优点:

    操作简单,时间短;

    结果客观,易于判读,减少人为因素的影响;

    除FEEP样本外,还使用其他类型样本组织。

  • RT-PCR检测RET融合:

    主要优势:可以鉴定已知的特异性RET融合伴侣,也可用于细胞标本的检测;

    主要缺点:不能检测新型或未知的融合伴侣,会低估RET融合发生率;

    经福尔马林处理标本RNA降解或质量下降也会影响结果。

(3)NGS可检测RET融合:

  • 主要优势:可提供精准、敏感的RET基因信息,即使肿瘤细胞在样本中比例较低时也可进行检测;

  • 主要缺点:程序复杂,数据庞大解读困难,费用昂贵。


5、RET融合NSCLC治疗:

  • 多靶点抑制剂:RET抑制剂总体临床缓解和中位PFS低于其他驱动基因相关抑制剂。


八、NTRK融合:

TRK信号通路的改变包括基因融合、蛋白过表达或单核首酸变异;


1、发生率:

  • NTRK融合基因是肺腺癌驱动基因之一,发生率约0.1-3.5%。


2、NTRK融合伴侣:

  • 融合伴侣基因有 MPRIP-NTRK1、CD74-NTRK1、TPM3-NTRK1、TRIM24-NTRK和SQSTMI-NTRK1。


3、治疗药物:

  • 有效在研药物:Larotrectinlb(LOxO-101)-TRKA,TRKB和TRKC的特异性酪氨酸激酶抑制剂;

  • 耐药机制:获得性耐药机制是TRK基因发生二次突变,如TRKA出现G595R突变,或TRKC出现G623R 突变;

  • 克服上述耐药突变的第二代TRK靶向药物LOXO-195已经研制成功,正进行临床研究中。


4、NTRK融合检测方法:

  • LOXO推荐使用 FoundationOne® CDx检测NTRK融合;

  • 可选技术包括:

    IHC:抗TRKA单抗,抗TRKB单抗,抗TRKC单抗;

    FISH:商业化的探针多为NTRK3重排;

    RT-PCR:针对NTRK1/NTRK2/NTRK3的特异探针;

    NGS:基于DNA、RNA或DNA/RNA panel;

  • 不同方法比较:

    NTRK没有明确的热点区域,融合伴侣众多,且序列较长,对NGS检测的要求和难度较高;

    传统检测手段无法一次覆盖所有潜在NTRK的融合区域。


传统基因检测方法已不能完全满足临床所需,NGS检测的应用逐渐广泛

  • 传统基因检测方法的缺陷:

    覆盖基因有限;

    存在漏检风险;

    可能因组织样本耗竭而影响后续检测;

  • NGS在NSCLC中的临床应用:早期发现,分子分型,用药指导,疗效预测,复发监控,预后评估。泛基因检测:给患者带来更多靶向治疗的机会;

  • NSCLC基因检测规范化之路正在路上:

    2020年,我国专家发表《二代测序技术在非小细胞肺癌中的临床应用中国专家共识》,旨在为我国NSCLC诊疗临床规范使用NGS这一新型检测技术提供指引,提升精准医疗发展进程。


九、PD-L1:

  • 免疫检查点抑制剂逐步步入NSCLC临床常规,PD-L1是目前最成熟,应用最广泛的指标;

  • PD-L1检测已被NCCN指南推荐作为晚期NSCLC检测项目,初诊时推荐与驱动基因检测同时进行,结合PD-L1进行治疗选择;

  • PD-L1抗体及检测平台:目前,优先推荐DAKO-22C3抗体;

 


现阶段,NSCLC分子检测仍存在挑战:

  • 样本质量:质量控制对于确保诊断结果的一致性和可靠性至关重要,所有检测实验室应定期进行室内质控和室间质评;

  • 检测周期:从实验室角度来看,加快检测周期有赖于充足的基础设施和人员配备;

  • 多学科协作:可建立多学科肿瘤委员会,加强内科医生、肿瘤学家和病理学家之间的密切联系;

  • 结果判读/医师教育:为获取准确的结果判读,应对参与诊断肿痛标本和报告的医生进行指导和教育。




   
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关键词:
EGFR,检测,基因,耐药,融合

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