「肺」你莫属，乘风破浪的RET学习笔记（一）下

• 分子图谱已经改变了对肺癌的分类和治疗策略；

• 对于晚期NSCLC初诊时即需要进行驱动基因检测以确定分子分型，从而采用相应的靶向药物治疗，对于驱动基因阴性的患者，需要进行PD-L1检测，以指导免疫治疗；

• 近10年来，NCCN不断更新肺癌生物标志物，越来越多的罕见靶点被推荐。

• 2020 v1 版NCCN指南：

  分子检测需要在第一时间满足治疗需求；

  必检项目：EGFR，ALK，ROS1，BRAF，PD-L1；

  可检项目：MET，RET，HER2，TMB；

  NCCN指南推荐广泛多基因平行检测，最大化罕见驱动基因的检出率，为患者提供可及的靶向药物。

• 2020 CSCO非小细胞肺癌指南：推荐罕见驱动基因检测

• 越来越多的生物标志物具有获批的治疗药物

EGFR引发的精准诊疗革命——治疗获益大幅提升

1、精准诊疗带我们在EGFR突变人群走过的历程：

• 不经选择化疗患者→根据体征选择优势人群→携带可靶治疗变异的患者→接受克服耐药治疗的患者；

• 药物的引进也推进了检测的进展。

2、EGFR突变的检测方法：

• 从传统的Sanger测序到ARMS，DDPCR，NGS：随着检测技术的发展，敏感性越来越高，需要的样本量也减少，甚至细胞或液体标本也可以进行检测。

3、突变频率：

• EGFR突变中93%出现在18-21号外显子，超过80%为Del19及L858R；

• 罕见突变17%，主要包括18外显子上的G719X，E709X，Del18，19外显子上的ins19，20号外显子上的ins20，S7681，21号外显子L861Q。

4、检测技术：

• NGS更全面更精准呈现肺癌患者EGFR基因突变特征：

  ARMS方法检测EGFR 29种基因突变，其中19del突变类型仅19个，而燃石数据库NGS检测测得44种EGFR 19 del亚型。

5、罕见突变：

（1）NCCN指南关于EGFR罕见突变推荐：

• 不仅要检测常见突变，也要检测少见突变，EGFR少见突变约占EGFR突变的10%，如：Exon19ins，L861Q，G719X，S768I，这些突变同样对TKI治疗敏感；

• Exon20插入突变中除A763-Y764insFQEA突变对TKI治疗敏感外，大多数Exon20插入突变可预测TKI耐药。

（2）EGFR罕见突变的特征：

• 一项研究中，1837例EGFR突变样本中，218个样本（11.9%）为罕见突变，其中男性患者（54.1% vs. 44.4%，P=0.007）和吸烟患者（30.7% vs. 24.3%。P=0.039）出现罕见EGFR突变的几率高于常见突变；

• 罕见突变的总体分布情况：G719X 21%，20INS 31%，T790M 14%，Complex L858R 17%，其他17%。

（3）检测罕见突变的必要性：

• EGFR不同变异位点对TKI的疗效反应有差异，常见突变位点之间，不同药物之间疗效也不尽相同，少见突变如Exon20插入突变中A763-Y764insFQEA突变对TKI治疗敏感，其余Exon20插入突变对TKI耐药，因此需要深入识别变异位点，实现精准治疗。

• EGFR TKI对Exon18突变的敏感性：不同突变位点对一代、二代及三代TKI敏感性不同。

  少见突变Del18，E709K和G719A对一代和三代TKI的敏感性不如Del19，三者中Del18更差；

  E709K和G719A对TKI的IC90相近，对一代TKI有一定的敏感性；

  Del18，E709K和G719A对二代TKI更敏感。

• EGFR 20号外显子不同插入变异体对EGFR-TKI的反应不同：

  EGFR 20号外显子插入突变是EGFR突变的第三大类型，多发生于C螺旋之后的Met766-Cys775，少数位于C螺旋的Glu762-Tyr764.

  20号外显子前端插入对TKI敏感，后端插入对TKI耐药。A763-Y764insFQEA的患者可以考虑使用TKI治疗，其他位点则不适合TKI治疗。

6、EGFR融合：

• EGFR融合为肺癌新的治疗靶点

• 一项研究显示，5例转移性肺癌患者，采用 FoundationOne® 进行基因检测，结果他们的肿瘤都具有EGFR融合（EGFR-RAD51和EGFR-PURB）。其中4人接受EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）治疗有应答。

7、耐药：

• EGFR突变晚期NSCLC患者靶向治疗后不可避免会发生耐药。

• 耐药机制：

  一代/二代EGFR-TKIs获得性耐药机制主要是20号外显子T790M突变；

  三代EGFR-TKIs一线治疗获得性耐药机制包括：EGFR突变（如L718Q、C797S），旁路激活（如MET扩增，HER2扩增）等。

  因此，对于EGFR-TKIs耐药的患者需要再次活检明确耐药机制，以指导后续治疗。

  NGS助力发现EGFR TKI原发与获得性耐药机制：

• 当EGFR突变伴发TP53突变，HER2扩增，MET扩增时，TKI疗效差，因此，FoundationOne® CDx 可帮助识别EGFR TKI有效治疗人群。

1、ALK融合基因的发现及ALK融合阳性NSCLC治疗进展：

• 2007年首次在非小细胞肺癌中发现EML4-ALK融合基因，并能独立成瘤；

• 磷酸激酶区在各种ALK融合蛋白中稳定表达，使得抗ALK激酶抑制剂获得成功；

• ALK融合基因阳性NSCLC靶向治疗日益成熟，给患者带来显著获益。

2、ALK应进行常规检测，各指南对于ALK检测的推荐：

3、检测方法：

• 融合基因检测可以从DNA、RNA、蛋白层面进行，检测方法包括FISH、NGS、RT-PCR、IHC。

• NPMA批准四种方法用于ALK融合的检测：

（1）基于DNA的荧光原位杂交（FISH）检测ALK重排－－－金标准

• 原理：直接/间接标记了荧光的单链DNA（探针）与其互补的目标样本DNA（玻片上的标本）退火杂交，通过观察荧光信号在染色体上的位置反映相应染色体或DNA序列的情况。

• 判读：

  雅培 Vysls ALK 分离探针试剂盒采用“分离”分析，基因倒位和ALK重排后，红色和绿色探针分开。

  样本中≥15%细胞红色和绿色信号分开或绿色信号缺失，判断为阳性，即为ALK基因相关易位。

  FISH假阴性的原因：ALK-EML4倒位融合后伴有不同位置或区段的缺失，而导致红点缺失或红绿都缺失等情况，导致不满足上述两类阳性信号类型的判读。

  当处于临界值附近、出现单绿信号、伴有扩增等不确定的情况时，建议使用其他技术平台复检。

• FISH检测基因重排的优势和局限性：

  优势：

  分离信号直观可信；大部分病例容易判断。

  几乎没有假阳性；

  仍是融合基因判读的金标准。

  
  

  局限性：

  对操作和判读技术要求较高；

  少于50个肿瘤细胞进行判读有局限性；

  FISH判读接近cut off存在商榷之处；

  保存年份久/前处理欠佳的病例可能出现信号弱的倩况；

  异常信号特征的判断需要进一步验证；

  无法适用于大规模筛查。

（2）基于RNA的检测（RT-PCR）：检测已知融合，未包含NSCLC中的罕见融合类型

• 在非小细胞肺癌中已确定了几种EML4-ALK融合变异体，并证明其具有功能活性。

• 转化需要ALK酪氨酸激酶的活性。

• 越来越多的罕见融合类型被发现。

• RT-PCR平台注意事项：

  仅能检测已知融合基因类型；

  检测环境及标本质量要求高；

  阈值附近样本需谨慎，必要时换平台复检。

（3）IHC-Ventana D5F3 平台注意事项：

• 非腺癌病例判读需谨慎；

• 富含钻液分泌的病例要格外留意阳性信号的部位及真假；

• 排除已知的染色元素，包括：肺泡巨噬细胞、神经纤维及神经节细胞、呼吸道上皮细胞、坏死组织碎片及细胞外黏液吸附；

• 标本的规范化处理，室内质控、室问质评尤为重要；

• 结果不确定时，使用其他技术平台行进一步复检。

（4）NGS优势：

• 能够检出特殊的、少见的融合类型，可区分融合类型，可发现新的融合。Non-EML4融合大约占1/4；至少有30余种不同的partner已被报道；

• NGS可检测ALK耐药机制：包括ALK非依赖性与依赖性耐药机制。

ALK非依赖性的耐药机制：

• 替代性致癌驱动基因：

  这一作用与EML4-ALK无关；

  已在ALK融合蛋白的上游和下游识别到替代性致癌驱动基因：KIT（扩增）、EGFR（突变和激活）、KRAS（突变和扩增）、IGF-1R（表达和激活）、IRS-1（表达）、MET（激活）、MEK（突变）；

• 组织学类型转化：如NSCLC转化为SCLC；

ALK依赖性的耐药机制（继发性耐药）：

• ALK激酶区突变，拷贝数增加；

• 一代、二代ALK抑制剂继发性耐药突变的差异：

  一代TKI主要耐药突变：L1196M和G1269A；

  二代TKI主要耐药突变：G1202R；

  二代ALK抑制剂更多出现ALK耐药突变，达50-70%。

4、融合基因检测技术的优劣势：

ALK检测样本类型及检测策略优化推荐（中国非小细胞肺癌ALK检测临床实践专家共识）：

• ALK检测标本类型：

  检测标本优先使用肿瘤组织标本（强烈推荐）；

  肿瘤组织标本不满足要求时，稚荐使用细胞学标本（推荐）；

  对于少数客观上不能获得组织或细胞学标本的晚期肺癌患者，可尝试血液朋亩脊液检测（专家共识意见）；

• ALK检侧策略优化：

  目前，NMPA批准了4个技术平台的 ALK 基因检测随诊断试剂，包括 ALK Ventana -D5F3 IHC、FISH 、 RT-PCR、NGS检测平台。专家组强烈推荐这4种方法均可用于A LK基因融合检测；

  优先应用Ventana-D5F3 IHC进行ALK检测（强烈推荐）；

  当和其他基因（如EGFR、ROSI 等）一起检测时，可以联合FISH和RT-PCR，或进行 RT-PCR 或NGS多基因检测（推荐）。

 ALK FISH vs IHC：临床疗效是金标准

• ALK FISH（-）/IHC（+）可能原因：

  FISH假阴性（易位机制）：ALKi 治疗有效；

  IHC假阳性（判读）：ALKi 治疗无效；

• ALK FISH（+）/IHC（-）可能原因：组织处理；IHC染色。

ROS1阳性NSCLC是NSCLC的独特分子亚型

1、ROS1阳性NSCLC的发现历程：

• 2007年，首次发现NSCLC患者和细胞株中存在ROS1融合；

• 2008年，发现ALK抑制剂TAE684和克唑替尼抑制ROS1融合NSCLC细胞株活性；

• 2009年，克唑替尼PROFILE研究扩展了ROS1队列；

• 2012年，证实克唑替尼对ROS1融合NSCLC患者有抗肿瘤活性，将ROS1阳性定义为特定亚型；

• 2014年，PROFILE 1001 ROS1队列研究结果发表；

• 2016年，亚裔OO 12-01研究结果发表。

2、ROS1阳性NSCLC存在多种融合类型：

• ROS1总共有14种不同的融合伴侣；

• CD74-ROS1融合型有更高的脑转移率；

• 非CD74-ROS1融合型拥有更长的PFS和OS。

3、ROS1检测方法：

• ROS1不同检测方法的比较：

• ROS1重复序列对NGS检测的影响———假阴性

  （1）ROS1 NGS检测由于存在插入点重复序列，影响NGS分析时Mapping结果，可能导致假阴性；

  （2）ROS1基因断裂点不确定，不仅存在于32、34、35、36号外显-内含子区域，探针设计要求高。

• ROS1重复序列对探针设计和检测的影响———假阳性

  融合基因插入点在ROS1重复序列，导致自动过滤失败，造成假阳性

  
  

• ROS1检测：NGS与其他方法学比较

  一项研究中23 例 ROS1阳性样本：

  FISH：检测20例，2例阴性。融合伴侣基因与ROS1非常接近等原因可导致FISH结果假阴性。

  RNA based NGS：检测19例，3例阴性，质量控制（QC）不通过，影响检出率。

  DNA based NGS：检测18例，4例阴性。内含子测序覆盖困难，将导致DNA based NGS 无法检测到断裂点发生在未测序区域的ROSI重排。

• DNA/RNA based NGS联合检测：

  MSK-IMPACT（DNA -based NGS）检测2502例肺腺癌标本，在276例阴性样本中取25例再进行RNA-Based NGS：36个样本被检测出融合，其中33个为actionable；11位患者接受靶向药治疗，8例患者获益。

1、BRAF突变：

• 在NSCLC发生率约2-3 %；

• 主要集中在11和15外显子，半数为15号外显子第600氨基酸变化（V600E），其次为11号外显子G469A及15号外显子D594G。

2、BRAF基因融合：

• 在一项全基因组测序中，发现BRAF融合发生率0.2%；

• BRAF融合突变发现在内含子9和10上，最常见融合体为AGK , DOCK4和TRIM24等。

3、BRAF抑制剂治疗BRAF突变型NSCLC：

• BRAF-TKI达拉非尼+MEK-TKI曲美替尼的联合治疗是FDA批准的BRAF V600E突变NSCLC治疗方案，总有效率超60%，显著改善了患者生存。

1、指南推荐：

（1）MET 14外显子跳跃突变纳入2020年NCCN/CSCO指南，推荐常规检测

（2）MET扩增纳入2020年NCCN/CSCO指南关注范围

• 在分子检测部分，NCCN指南建议对于EGFR-TKI耐药患者，如果没有检测到T790M，应该进行MET扩增复测。

• 在分子分型部分，CSCO指南建议MET扩增应该作为常规检测（组织优先血液补充）。

2、MET14外显子跳跃突变：

（1）临床特征及发生率：

• MET EX14m见于1-3% NSCLC

• 在肺肉瘤样癌（PSC）中MET Ex14m+可高达31.8%

• MET Ex14m+同时合并MET扩增：15-20%

• MET Ex14m是NSCLC独立的驱动基因，通常与其他基因变异相互排斥，如EGFR、ALK、ROS1

• MET 14外显子跳跃突变多见于高龄、男性、晚期NSCLC患者

（2）检测方法：

• NGS和PCR为MET 14外显子跳跃突变的主要检测方法

• MET 通路异常有多种检测方法，不同类型的MET改变检测方法不同

• NGS和PCR检测MET 14 外显子跳跃突变的优缺点：

• RNA 转录剪接缺陷对DNA based NGS检测的影响：

  MET exon 14 Skipping：体细胞MET基因剪切位点的突变会导致RNA水平MET基因14号外显子的沉默，被称为met14跳跃缺失。

  DNA水平检测MET exon 14 skipping会发生一定几率错检及漏检。

  RNA水平检测到13外显子与15外显子发生拼接，则可直观性判读发生MET 14外显子跳跃突变。

• 组织样本中不同检测方法比较：

• RT-PCR与Sanger测序比较：前者敏感性100.0%，特异性97.4%；后者敏感性61.5%，特异性100.0%。

• RNA-based与DNA-based NGS比较：

  相比RNA-based的方法，利用DNA based的方法必须保证所有的突变类型都被检测出来，覆盖区域不够可能会导致漏检；

  DNA-NGS检测中，当引物未同时靶向13号内含子的39个剪接点和14号内含子的59个剪接点时，可能不能检测到肺癌中MET4外显子跳跃突变的发生，而RNA-NGS可能会检测到此类事件；

  NCCN指南推荐：分子检测部分，建议如果可能的话尽量采用大panel的二代NGS基因检测，如果内有检测到驱动基因，尤其对于非吸烟者，建议采用基于RNA为基础的NGS复测。

3、MET扩增：

（1）MET扩增是一代/二代EGFR-TKI耐药机制，但其发生率不同：

• 初治患者中：约2-4%；

• 一代、二代EGFR-TKI耐药患者中：约5-22%；

• 一线奥希替尼耐药患者中：约15%；

• 二线奥希替尼耐药患者中：约19%。

（2）检测方法：

• FISH、NGS、数字PCR和IHC都可以用于检测MET扩增/过表达；

• MET扩增是连续变量，如何找到可以使患者获益的阈值非常关键：

  MET扩增程度在自然人群中的分布是偏态分布的，扩增程度越高，人群越少；

• MET扩增检测：FISH是组织检测金标准，但是FISH判读存在不同标准。

• 研究显示，基于FISH检测，MET扩增越高，接受MET-TKI疗效越好

• FISH与NGS比较：

  以FISH为参照，有限的数据表明组织NGS仅能测出1/2的MET扩增；

  以FISH为参照，组织NGS的特异性高，但敏感性仅为48%；

  相较于FISH，组织NGS能检测出大部分定点扩增，但多倍体被遗漏，可能是因为多倍体通常在NGS生信解读时被过滤了，未被报告。

• HER2在肺腺癌中的扩增频率是2-5%，HER2基因突变在肺腺癌出现的频率是2-3%，不过所有的突变都发生在第20号外显子上。以免疫组化检测的HER2蛋白高表达的比例为2-4%。

• HER2基因突变与扩增相互独立发生；

• HER2突变的NSCLC治疗：泛HER抑制剂，HER2 exon 20抑制剂，抗体-抗体药物耦合物。

1、发生率：RET融合在肺癌发生率约1-2%。

2、RET融合伴侣类型：

3、RET融合NSCLC患者的临床特征：

患者更年轻，不吸烟，拥有其他致癌性驱动基因的可能性更低，肿瘤细胞中印戒细胞比例≥10%，肿瘤体积更小，更早发生淋巴结转移，低分化。

4、检测方法：

（1）荧光原位杂交（FISH）是检测RET融合的金标准：

• 主要优势：敏感性高，且与融合伴侣无关；

• 主要缺点：费用高、需要专业的技术力量，仅能在大的中心进行，无法提供特殊RET融合伴侣的信息。

（2）RT-PCR目前应用于绝大多数的RET筛查研究中：

• RT-PCR的优点：

  操作简单，时间短；

  结果客观，易于判读，减少人为因素的影响；

  除FEEP样本外，还使用其他类型样本组织。

• RT-PCR检测RET融合：

  主要优势：可以鉴定已知的特异性RET融合伴侣，也可用于细胞标本的检测；

  主要缺点：不能检测新型或未知的融合伴侣，会低估RET融合发生率；

  经福尔马林处理标本RNA降解或质量下降也会影响结果。

（3）NGS可检测RET融合：

• 主要优势：可提供精准、敏感的RET基因信息，即使肿瘤细胞在样本中比例较低时也可进行检测；

• 主要缺点：程序复杂，数据庞大解读困难，费用昂贵。

5、RET融合NSCLC治疗：

• 多靶点抑制剂：RET抑制剂总体临床缓解和中位PFS低于其他驱动基因相关抑制剂。

TRK信号通路的改变包括基因融合、蛋白过表达或单核首酸变异；

1、发生率：

• NTRK融合基因是肺腺癌驱动基因之一，发生率约0.1-3.5%。

2、NTRK融合伴侣：

• 融合伴侣基因有 MPRIP-NTRK1、CD74-NTRK1、TPM3-NTRK1、TRIM24-NTRK和SQSTMI-NTRK1。

  
  

3、治疗药物：

• 有效在研药物：Larotrectinlb（LOxO-101）-TRKA，TRKB和TRKC的特异性酪氨酸激酶抑制剂；

• 耐药机制：获得性耐药机制是TRK基因发生二次突变，如TRKA出现G595R突变，或TRKC出现G623R 突变；

• 克服上述耐药突变的第二代TRK靶向药物LOXO-195已经研制成功，正进行临床研究中。

4、NTRK融合检测方法：

• LOXO推荐使用 FoundationOne® CDx检测NTRK融合；

• 可选技术包括：

  IHC：抗TRKA单抗，抗TRKB单抗，抗TRKC单抗；

  FISH：商业化的探针多为NTRK3重排；

  RT-PCR：针对NTRK1/NTRK2/NTRK3的特异探针；

  NGS：基于DNA、RNA或DNA/RNA panel；

• 不同方法比较：

  NTRK没有明确的热点区域，融合伴侣众多，且序列较长，对NGS检测的要求和难度较高；

  传统检测手段无法一次覆盖所有潜在NTRK的融合区域。

  
  

传统基因检测方法已不能完全满足临床所需，NGS检测的应用逐渐广泛

• 传统基因检测方法的缺陷：

  覆盖基因有限；

  存在漏检风险；

  可能因组织样本耗竭而影响后续检测；

• NGS在NSCLC中的临床应用：早期发现，分子分型，用药指导，疗效预测，复发监控，预后评估。泛基因检测：给患者带来更多靶向治疗的机会；

• NSCLC基因检测规范化之路正在路上：

  2020年，我国专家发表《二代测序技术在非小细胞肺癌中的临床应用中国专家共识》，旨在为我国NSCLC诊疗临床规范使用NGS这一新型检测技术提供指引，提升精准医疗发展进程。

• 免疫检查点抑制剂逐步步入NSCLC临床常规，PD-L1是目前最成熟，应用最广泛的指标；

• PD-L1检测已被NCCN指南推荐作为晚期NSCLC检测项目，初诊时推荐与驱动基因检测同时进行，结合PD-L1进行治疗选择；

• PD-L1抗体及检测平台：目前，优先推荐DAKO-22C3抗体；

• 样本质量：质量控制对于确保诊断结果的一致性和可靠性至关重要，所有检测实验室应定期进行室内质控和室间质评；

• 检测周期：从实验室角度来看，加快检测周期有赖于充足的基础设施和人员配备；

• 多学科协作：可建立多学科肿瘤委员会，加强内科医生、肿瘤学家和病理学家之间的密切联系；

• 结果判读/医师教育：为获取准确的结果判读，应对参与诊断肿痛标本和报告的医生进行指导和教育。