全身麻醉药对发育神经元的神经毒性作用与线粒体动力学的关系

首都医科大学附属北京友谊医院科研启动基金（yyqdkt2018‑23）

【综述】

近年针对全身麻醉药神经毒性作用进行的大量动物实验证实：将处于发育高峰期的神经元暴露于全身麻醉药会产生明确的神经元损伤或神经退行性病变，进而导致成长后学习记忆能力的下降 。然而大量临床研究的结果却不尽相同，最近一项涉及7个国家28家医疗机构的随机对照研究发现：对婴幼儿行单次、短暂（<1 h）的全身麻醉，并不影响其成年后神经发育结果 。但仍有研究发现，2岁以内接受全身麻醉的婴幼儿与未接受过麻醉的对照组相比，多次麻醉（>3次）是患儿成长过程中出现学习记忆能力障碍的独立危险因素 。尽管众多研究结果存在争议，2016年美国食品药品监督管理局仍然发出了一项“药物安全公告” ：3岁以下婴幼儿、第三孕期孕妇接受手术、医疗操作期间重复及长时间应用全身麻醉药或镇静药可能会影响小儿脑发育。目前，也陆续有研究关注全身麻醉药对发育神经元神经毒性作用的预防和治疗，如右美托咪定的应用或一些相应受体拮抗剂的使用对神经毒性作用的改善等 ，但是具体的保护机制仍然不明，同时，仍然局限于动物实验。在众多全身麻醉药神经毒性作用机制的研究中，线粒体在其毒性机制及可能的保护因素中所占据的地位越来越引发人们的重视。现结合线粒体的结构、功能特性，对全身麻醉药发育期神经毒性作用的线粒体机制及其与线粒体动力学相关关系进行阐述。  

线粒体是细胞进行有氧呼吸产生能量的主要场所。线粒体功能与其形态结构密切相关，电镜下，线粒体外膜较光滑，起细胞器界膜的作用；内膜高度折叠并向内突出形成嵴，负担许多生化反应。真核细胞ATP的生成主要在线粒体中进行。营养物质经柠檬酸循环或其他代谢途径行脱氢反应，产生的成对氢原子经线粒体氧化呼吸链电子传递释放能量，此释能过程驱动ADP磷酸化生成ATP。氧化呼吸链由位于线粒体内膜上的4种蛋白酶复合体组成，分别为复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。复合体Ⅴ为ATP合酶，也位于线粒体内膜，催化ADP与Pi生成ATP。线粒体的健康对维持细胞正常功能十分重要。

近年来研究显示，线粒体是一个不断进行分裂、融合动态变化的细胞器，并且可以在细胞内重新分布，这种特性统称为线粒体动力学 。另有研究发现，线粒体的形态可能决定了细胞内能量供应水平和呼吸代谢方式。融合状态的线粒体内部嵴结构丰富，位于内膜上的氧化呼吸链蛋白酶复合体接触紧密，氧化磷酸化效率较高。而处于分裂状态的线粒体氧化磷酸化作用减弱 。线粒体通过不断分裂融合来维持自身稳态，同时保证细胞生命活动的正常进行，维持机体健康。  

对于人类而言，神经系统的发育是从妊娠第5周开始，持续至婴幼儿期，特别是妊娠后期及新生儿期是中枢神经系统结构重塑和突触形成的关键时期 。在神经元中，线粒体不仅是产生能量的主要场所，还参与建立神经元细胞膜的兴奋性，并执行突触传递和神经元可塑性等复杂过程 。由于神经元对线粒体高度依赖，所以线粒体功能障碍可以导致多种神经系统疾病 。全身麻醉药发育期神经毒性作用的线粒体机制可能存在以下几种：

2.1　全身麻醉药引起线粒体结构功能改变导致神经毒性

线粒体通透性转变孔（mitochondrial permeability transition pore, MPTP）是存在于线粒体内外膜之间的一组蛋白复合体，是线粒体调控细胞凋亡的关键环节 。生理状态下，MPTP周期性开放，线粒体外的正离子进入线粒体内，而线粒体内膜的质子泵将其基质中的质子泵入胞质，以维持线粒体内负外正的跨膜电位，保持其结构功能的稳定。B细胞淋巴瘤2（B cell lymphoma 2, Bcl‑2）家族蛋白对MPTP的开放和关闭起关键的调节作用，促凋亡蛋白Bcl‑2蛋白相关X蛋白（Bcl‑2 associated X protein, Bax）等与MPTP结合可引起MPTP持续性开放，而抗凋亡蛋白Bcl‑2、B细胞淋巴瘤‑xl（B‑cell lymphoma‑extra large, BCL‑xl）等不仅可以直接阻止Bax对MPTP的这种作用，还可以与Bax竞争性结合MPTP从而发挥抗调亡作用 。有研究发现，使用七氟醚处理出生7 d的SD幼鼠可增加Bax蛋白的表达，同时降低Bcl‑2蛋白的表达水平 ，从而引起发育期神经毒性作用。另有研究证实，静脉全身麻醉药丙泊酚是通过诱导线粒体过度分裂从而引起MPTP的早期开放，最终导致细胞死亡。使用线粒体分裂蛋白抑制剂对神经元行预处理，发现MPTP的提前开放及细胞死亡均得到了抑制，进一步表明丙泊酚诱导的MPTP提前开放是通过线粒体过度分裂这一机制实现的 。

2.2　全身麻醉药通过氧化应激引起线粒体损伤从而导致神经毒性

由于神经系统内多不饱和脂肪酸含量高，对能量需求高，同时抗氧化途径相对较弱，所以易受氧化应激的影响。研究表明，麻醉药物可诱导发育中的大脑产生氧化应激和线粒体功能障碍：使用2%异氟醚处理原始神经元6 h可增加活性氧（reactive oxygen species, ROS）的体外积累 。线粒体不仅是ROS的生成场所，也是ROS的重要攻击靶点。在氧化磷酸化过程中，位于线粒体内膜上的电子传递链中有多个组分均可产生ROS。由于线粒体DNA缺乏组蛋白保护，且与线粒体内膜相距较近，故极易受到代谢过程中产生的大量氧自由基的攻击，从而引起线粒体功能障碍。研究表明，静脉麻醉药氯胺酮可增加人类胚胎干细胞源性神经元内ROS及线粒体超氧化物的生成引起神经元凋亡，使用抗氧化剂可以抑制这种线粒体损伤 。

2.3　全身麻醉药直接破坏线粒体呼吸链产生神经毒性作用

线粒体是真核生物进行氧化代谢的部位，呼吸链中电子传递是氧化磷酸化的关键步骤，麻醉药物可以直接破坏神经元的呼吸链从而干扰线粒体氧化磷酸化及能量生成。吸入麻醉药氟烷、异氟醚、七氟醚可以抑制线粒体复合物Ⅰ的活性 。静脉麻醉药中，高浓度芬太尼（>10 g/ml）和瑞芬太尼干扰线粒体电子链中复合物Ⅲ、Ⅳ及复合物Ⅴ的活性 。有研究发现，在大鼠和人类大脑皮质突触体中，七氟醚和静脉麻醉药丙泊酚均可以抑制复合物V的活性 。线粒体呼吸链的功能紊乱又会增加氧自由基生成，从而形成恶性循环，加重细胞损伤。

2.4　全身麻醉药干扰线粒体动力学引起神经毒性作用

生理状态下，线粒体不断发生分裂融合，以维持其数目、形态、结构和功能的稳定。若该分裂融合的平衡发生紊乱，将导致线粒体功能障碍，ATP生成减少，导致细胞功能损害和疾病的发生 。有研究提出，线粒体动力学异常可能是细胞功能障碍的共同途径，对细胞凋亡起重要作用 。已有证据表明，吸入全身麻醉药异氟醚可以干扰线粒体动力学引起线粒体过度分裂甚至碎片化，最终导致发育期神经系统损伤 。使用20 mg/L的丙泊酚处理人类胚胎干细胞源性神经元6 h能显著增加线粒体分裂蛋白的活性，从而产生神经毒性作用 。  

3.1　线粒体动力学与细胞凋亡

线粒体是真核细胞内重要的细胞器，不仅能产生能量，还可以介导胞内钙离子和ROS信号转导，甚至调控细胞凋亡。线粒体的分裂融合主要受线粒体动力学相关蛋白的调控，包括调节线粒体分裂的动力相关蛋白1（dynamin‑related protein 1, drp‑1）、线粒体分裂因子、线粒体分裂蛋白1，调节线粒体融合的融合蛋白1、融合蛋白2、视神经萎缩蛋白1。drp‑1蛋白在生理状态下分布于细胞质，在伤害性刺激作用下，其表达增高并集合到线粒体外膜的分裂位点上形成环状结构介导外膜凹陷收缩，这是线粒体分裂最关键的一步，因此drp‑1蛋白的表达和活性决定了线粒体的稳态 。细胞中线粒体动力学相关蛋白存在一定的平衡机制，以此保持线粒体分裂融合的平衡，维持细胞的正常功能。

细胞凋亡是机体在特定的环境下，由基因调控的程序性细胞死亡。在中枢神经系统发育期，机体通过生理性的神经细胞凋亡消除体内冗余的神经元，调整神经网络，优化神经连接。然而在该过程中常用的全身麻醉药多数可加速生理性的神经细胞凋亡从而产生神经毒性作用。真核细胞主要通过内源性线粒体途径和死亡受体介导的外源性凋亡途径实现细胞凋亡，中枢神经系统发育期全身麻醉药神经毒性作用以内源性线粒体凋亡途径为主。该途径以线粒体通透性改变、细胞色素C（Cytochrome C, Cyt C）的外溢以及caspase的级联激活为主要特征，最终激活caspase‑3，使得胞质内蛋白裂解，细胞凋亡。

有研究认为，细胞凋亡与线粒体动力学变化有关，线粒体动力学失衡是细胞凋亡的早期表现 。全身麻醉药作用于发育期神经细胞可通过多种机制引起线粒体动力学紊乱产生神经毒性作用。有学者观察到，当细胞受到外界信号刺激时，在drp‑1蛋白表达增加、分布改变，导致线粒体分裂增强的同时，胞液中的促凋亡蛋白Bax也在线粒体外膜聚集，引起MPTP异常开放，线粒体膜通透性增强，Cyt C外溢 ，激活内源性线粒体凋亡途径引起细胞凋亡。drp‑1依赖的线粒体分裂增强可促进Cyt C释放和凋亡小体形成，而抑制drp‑1可阻断多种因素诱导的细胞凋亡 。有研究表明，使用drp‑1抑制剂Mdivi‑1抑制线粒体分裂可减轻神经元凋亡 。

3.2　全身麻醉药引起线粒体动力学改变的分子机制

3.2.1　氧化还原稳态失衡与线粒体动力学改变

全身麻醉药可以通过破坏发育期大鼠神经细胞氧化还原稳态，干扰线粒体分裂融合从而产生神经毒性作用 。氧化还原是生物体内最基本的化学反应过程。在生理和病理状态下，机体细胞可产生大量ROS，包括过氧化氢等。同时体内存在一套抗氧化体系，包括过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等。生理状态下，ROS与抗氧化体系相互抗衡共同维持氧化还原平衡。研究发现，将发育期大鼠早期暴露于全身麻醉下会通过下调超氧化物歧化酶活性，同时抑制过氧化氢酶活性的代偿性调节，从而导致ROS急性上调，氧化还原稳态失衡 。

全身麻醉药诱导产生的大量ROS参与了线粒体动力学相关蛋白的表达调控和翻译后修饰。ROS对线粒体分裂融合蛋白产生差异调节，抑制融合、促进分裂导致线粒体碎片化 。线粒体的分裂增强又进一步促进ROS的产生，形成恶性循环，并最终引起线粒体和细胞功能障碍。有研究表明，在全身麻醉同时给予ROS清除剂EUK‑134和线粒体保护剂PPX可以预防全身麻醉诱导的长期认知功能障碍 。

3.2.2　钙稳态紊乱与线粒体动力学改变

全身麻醉药可诱导发育期海马神经元内钙稳态紊乱，从而导致线粒体动力学失衡和神经元凋亡。钙离子作为细胞内重要的第二信使，介导许多生物化学反应，通过与多种底物蛋白结合而发挥其调节作用。在神经细胞内，钙离子在维护和稳定细胞骨架成分、突触形成及神经递质合成、释放中起着重要作用，同时通过多种信号通路调控线粒体动力学蛋白活性，进而调节线粒体动力学。在发育期神经元，全身麻醉药通过激活γ‑氨基丁酸A受体导致氯离子外流产生兴奋性突触后电位，继而NMDA受体激活及电压依赖性钙离子通道开放，胞外钙离子内流 。异氟醚还可激活神经元内质网上的三磷酸肌醇IP3受体，促进内质网储备的钙离子释放入胞质，导致胞内钙离子浓度持续升高 。有研究表明，胞质内持续升高的钙浓度可激活钙调神经磷酸酶（calcineurin, CaN），促进drp‑1蛋白去磷酸化，从而使drp‑1的活性增强 ，线粒体过度分裂，引起线粒体片段化甚至神经元凋亡。使用CaN抑制剂抑制其功能可使磷酸化drp‑1表达增高，提示drp‑1活性降低，从而减轻异氟醚所致线粒体动力学失衡和神经毒性作用 。

3.2.3　drp‑1的磷酸化修饰与线粒体动力学改变

在线粒体动力学相关蛋白中，drp‑1是促进分裂的主要蛋白，由4个结构域组成：GTPase结构域、中央结构域、可变结构域及GTPase效应器结构域。其中，可变结构域参与drp‑1的多种翻译后修饰过程（如磷酸化等），是drp‑1最活跃的区域。基础研究发现，drp‑1第616位丝氨酸磷酸化可引起drp‑1的活化，而第637位和第656位丝氨酸磷酸化则引起drp‑1的失活 。异氟醚作用于发育期神经元，通过激活CaN调节第637位丝氨酸去磷酸化，引起drp‑1活性增强最终导致细胞凋亡 。而丙泊酚作用于人类胚胎干细胞源性神经元，可通过调控细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶的表达，促进第616位丝氨酸磷酸化，使drp‑1活性增强，从而介导神经毒性作用。有研究表明，使用细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶的抑制剂rescovitine预处理神经元可减少丙泊酚引起的线粒体分裂，缓解神经毒性作用 。  

虽然大量的基础研究都表明全身麻醉药对发育期神经元存在神经毒性作用。然而，体外培养的神经元并不能真正代表人脑，人脑是由神经元和多种胶质细胞组成的。神经元和胶质细胞之间极为复杂的相互作用可能改变我们在基础研究中确定的信号通路以及神经元对全身麻醉药物的反应。同时，最新一项纳入了7个国家28家医疗机构722名研究对象的大型临床研究，最终提出对婴幼儿进行单次、短暂（小于1 h）的全身麻醉，并不影响其成年后的神经发育结果 。因此，全身麻醉药对发育期神经元的影响仍然有待进一步研究。

目前大量基础研究逐步发现针对全身麻醉药神经毒性作用的预防措施。有研究提出，线粒体分裂抑制剂Mdivi‑1预处理神经元不仅能保护线粒体的完整性，而且在促进细胞生长和调节突触活性方面还发挥直接作用，这提示Mdivi‑1对大鼠原代神经元培养具有保护作用 。这给我们未来行全身麻醉药神经毒性作用的相关研究提供了新思路。

线粒体中的许多通路都与全身麻醉药诱导的神经毒性作用相关，但各通路并不相互独立，而是彼此作用共同促进细胞凋亡。随着实验技术的发展，人们对于线粒体形态结构、动态变化及调控机制的认识越来越深入，未来对线粒体介导全身麻醉药神经毒性相关的分子机制应该有进一步的研究，以期为此类神经毒性作用的防治提供新策略。