如何系统全面的评价qPCR仪!

2021
01/25

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来源公众号:原博士带你做检测,转载已获授权。

荧光定量PCR的检测离不开荧光定量PCR试剂和荧光定量PCR仪器。试剂的评价前面已经讲了(诊断试剂评价系列2-核酸检测方法(更正))。但是每次提到荧光定量PCR仪的评价,大家总是望而却步。一方面原因是荧光定量PCR仪涉及很多温度、光电信号需要专业的设备来评估,另一方面也确实不知道从哪里入手。今天我梳理一下评价荧光定量PCR仪的指标和方法。由于本人非计量相关专业,文中可能存在错误,本文仅供参考,大家可以参照相关标准进行评价。

一、荧光定量PCR仪评价的核心指标


二、荧光定量PCR仪的温度性能试验相关指标

通过物理方法测定PCR性能的试验。主要包括测定温度和荧光来进行评价,由于需要专业的设备,建议联系计量部门或仪器厂家进行相关指标的测定。

温度示值误差: 
编辑并运行一个温度循环文件,在55±5℃,72±5℃,95±5℃各取一个温度点,设置恒温2min,测定值与设定值应不超过±0.5℃  
温度均匀性:
编辑并运行一个温度循环文件,在55±5℃,72±5℃,95±5℃各取一个温度点,设置恒温2min,5次循环,随机选取≥6个点位。温度差值在±1℃范围内。                                                                                                                     
(图片由北京林电伟业电子技术有限公司提供 )
温度最大过冲量:
荧光定量 PCR 仪均热块温度升高或降低至设定值过程中,所有采样测量孔温度超出设定值的最大幅度,应≤3℃。过冲时间和过冲温度体现了qPCR仪器的性能,对qPCR实验程序的影响巨大,后面会用实验来说明过冲的影响。   
 
(图片由北京林电伟业电子技术有限公司提供 )  
  1. 温度持续时间准确度:
    编辑并运行一个45℃和95℃之间循环的文件,设置温度≥1min,连续记录5个循环,温度持续时间与设定温度时间偏差在±5%以内
     
  2. 平均升温速率:50℃-90℃应不小于1.5℃/秒。
  3. 最大升温速率50℃-90℃应不小于2.5℃/秒。
  4. 平均降温速率:90℃-50℃应不小于1.5℃/秒。
  5. 最大降温速率:90℃-50℃应不小于2.0℃/秒。
三、荧光定量PCR仪的荧光性能试验相关指标
通过物理方法测定PCR性能的试验。主要包括测定温度和荧光来进行评价,由于需要专业的设备,建议联系计量部门或仪器厂家进行相关指标的测定。
    9.荧光强度检测精密度
    随机选取10个及以上个检测孔,用高中低浓度校准染料进行检测,各浓度校准染料重复测定的变异系数5%。
    10.荧光强度检测重复性:
    用高中低浓度校准染料各随机选择1个孔,重复检测10次,各浓度校准染料重复测定的变异系数3%
    11.不同通道荧光干扰
    随机选择2个通道,配置非目标通道的荧光染料溶液,其他通道荧光检测强度不高于目标通道荧光阈值。
(图片来网络,版权归原作者所有)
    12.荧光线性
    将已知浓度标准荧光染料梯度稀释后(至少稀释 5 个梯度)进行测量,每一浓度梯度平行测试3孔,计算线性相关系数,应≥0.990。
四、荧光定量PCR仪的生物化学试验相关指标

对温度敏感的PCR反应对PCR仪进行生化性能试验。该指标可以通过荧光定量PCR的试验对仪器进行评价,每个核酸检测实验室都可以开展的评价试验。
     13.样本线性
     将已知核酸浓度样本按照5倍或10倍梯度稀释后(至少稀释 5 个梯度),按照项目选用对应的试剂进行检测,每一浓度梯度平行测试3孔,计算线性相关系数,应≥0.980。
    14.样本检测重复性
    对高中低浓度核酸样本进行检测,每一浓度重复检测10次,计算Ct值变异系数应3%。
(图片来网络,版权归原作者所有)
五、荧光定量PCR仪评价的试验设计
1.试验准备
1.1有证标准物质
国内外有证标准物质,标准物质类型为质粒DNA或RNA。不推荐使用自制没有进行定量的质控品。
1.2荧光染料
建议购买标准荧光染料。
1.3.荧光定量PCR方法
需要使用经过验证过的荧光定量方法:扩增效率90%-110%(越接近100%越好);R2大于0.99;最低检测限应低于10 copies/反应。
1.4.反应体系
质量高口碑好的反应体系。
1.5.耗材
仪器推荐使用的专用于荧光定量PCR的耗材,经过校准的移液器。
1.6.荧光定量PCR反应条件
常规荧光定量PCR反应条件,普通模式,40个循环。不建议使用快速模式和预扩增反应条件。
2.重复性试验
选择高中低浓度标准物质进行检测(推荐浓度为5000 copies/反应、500 copies/反应和50 copies/反应),每个浓度至少5次重复,样品管随机放置在反应板中心和边缘的不同位置 。Ct值变异系数不大于3%。
样品放置的位置尽可能分散,也可以如下图。

3.样本线性试验
对已知浓度的样品进行5倍或10倍梯度稀释(至少5个梯度),每一浓度梯度平行测试3孔,Ct均值的回归系数R不低于0.99。
4.荧光线性试验
对已知浓度的标准荧光染料进行梯度稀释(至少5个梯度),每一浓度梯度平行测试3孔,回归系数R不低于0.99。
5.不同荧光通道干扰试验
如果检测中使用双重或多重荧光检测,可设计如用FAM探针扩增用VIC通道检测,检测结果不应该有高于阈值线的荧光信号。
总结:荧光定量PCR仪的评价需要结合物理性能(温度和荧光)和生化性能(荧光定量PCR反应)才能获得仪器总体的表现。需要专业的计量机构结合实验室的常用检测项目(新冠、非瘟等)对qPCR仪进行系统性评价。核酸检测实验室日常使用已知浓度的有证标准物质定期对荧光定量PCR仪进行评价也至关重要。
参考文献:
  1. YY∕T 1173-2010 聚合酶链反应分析仪
  2. JJF1527-2015 聚合酶链反应分析仪校准规范
  3. SN/T 2102.2-2008 食源性病原体PCR检测技术规范 第2部分:PCR仪性能试验要求
  4. JJF(津)04-2020 实时荧光定量 PCR 仪校准规范
  5. JJF(苏)222-2019 实时荧光定量PCR仪校准规范
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关键词:
定量PCR,评价,荧光,浓度,核酸,线性

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