快速眼动睡眠在发育和学习过程中选择性修剪并维持新突触

快速眼动睡眠（REM）对大脑的成熟和记忆巩固有重要作用，多项研究表明，在发育期剥夺REM（REMD）会导致视觉系统发育缺陷以及成年后的行为改变；而成年后REMD将影响学习后行为改善程度。但脑干损伤患者被动的REM缺失并不会影响其认知功能，因此REM在发育和学习中的确切作用尚待探究。

大脑发育和可塑性的一个显著特征是，每天形成的大量新突触(多达5-10%)中，只有一小部分能在一段时间内稳定维持，目前认为这是因为大脑需要有选择地修剪和维持新突触以持续存储新信息而不会中断先前获得的记忆，同时消除发育和学习过程中虚假的神经元连接以增强神经元网络的信噪比。但这种选择过程的机制仍然未知。在发育早期，REM占总睡眠时间的比例高达50%以上，10岁前比例逐步下降，之后随学习时间的增加，REM比例再次增加。发育早期高比例的REM伴随广泛的突触形成和消除。也有研究表明，接触新事物后，REM期间将增加突触可塑性相关基因的表达。这些发现提示REM可能影响突触形成和维持过程，但REM是否参与了新突触的修剪或维持依旧不明。

作者研究了REM对小鼠初级运动皮层L5锥体神经元突触后树突棘的影响和机制，发现REM通过NMDA受体(NMDAR)依赖的树突钙离子尖峰介导的机制选择性地修剪和维持新的突触，从而促进大脑发育、学习和记忆存储。

作者首先对发育期小鼠进行研究。对L5锥体神经元的新棘突形成进行8小时观察后，进行后续8小时的分组干预（Fig.1a）。与P30小鼠（成熟期）对比，P21小鼠（发育期）有更高的棘突形成速度和REM比例（图1b,c）。REMD或NREMD为实验者观察到脑电和肌电波形实时特征（Fig.S1a）时，用棉签搔刮小鼠以实现相应睡眠阶段的选择性剥夺。该方法可以选择性地显著降低REM或NREM的比例和平均爆发时长，但对爆发频次和其它睡眠时相无显著影响（Fig.1d & Fig.S2a-c）。在8小时干预后发现，REMD可显著下调发育期小鼠新形成棘突的清除率而对既往存在棘突无影响（Fig.1e-g）。

接着作者研究了运动后小鼠的表现。作者让小鼠在跑步机上跑动8小时，跑带朝前（FW）或朝后（BW）运动，随后进行16小时干预（Fig.1h）。干预效果与发育期小鼠类似（Fig.1i，Fig.S3）。作者同样发现REMD下调了运动训练后小鼠新形成棘突的清除率而对既往存在棘突无影响（Fig.1j-n）。此外，作者发现即便延长训练时间到24个小时，随后12小时的REMD仍然能显著降低新形成棘突的清除率（Fig.S4）。

▲ Fig.1

▲ Fig.S1a

▲ Fig.S2

▲ Fig.S3

▲ Fig.S4

这种剪枝现象的意义是什么呢？作者在对发育期小鼠干预后继续观察8h（Fig.2a），发现在被清除的新棘突附近2μm范围内，REM可促进后续（16-24h）的新棘突形成（Fig.2b-c）。在运动后小鼠上也观察到了类似现象，且运动表现改善明显（Fig.2d-m）。提示REM可能参与平衡发育或学习诱导的新突触数量。 

▲ Fig.2

此外，作者发现REM还可以促进那些未被清除的新棘突生长，在发育期小鼠（Fig.3a-d）或运动训练后小鼠（Fig.3e-j）上均如此，也与运动表现改善有关（Fig.3k）。

▲ Fig.3

那么REM对新形成棘突的远期作用是什么呢？REMD后那些本该被清除而未被清除的棘突会带来怎样的影响呢？作者对发育期小鼠进行了4天的观察，发现REMD组新形成的棘突在四天后几乎全部消失，而在对照组和NREMD组，虽然在8-16小时新形成棘突清除速率较REMD组快，但4天后幸存棘突比例显著较高（Fig.4a-b）。对棘突生长情况的跟踪也可以证实，REM促进幸存棘突的生长而抑制已被清除的棘突生长（Fig.4c-d）。运动后小鼠上也观察到类似结果（Fig.4e-h, S5）。 

▲ Fig.4

▲ Fig.S5

为明确机制，作者使用双光子钙成像技术，对不同活动状态下小鼠位于L1的锥体细胞顶端树突钙活动进行了观察（Fig.5a）。作者发现运动中和REM期小鼠L1顶端树突钙活动较为频繁（Fig.5b）。而在给予MK801（非竞争性NMDA受体拮抗剂）后，REM期钙峰数量、幅值、峰值持续时间都显著下降（Fig5c-e）。由于MK801对钙活动的阻滞呈时间依赖，给药（连续3 次注射, 间隔50 ms）3min后钙活动基本恢复正常（Fig.5f），因此作者分别观察了在REM期给药和在NREM期给药后，REM期的钙离子活动（Fig.5g）。作者发现，在REM期给药可抑制超过90%的顶端树突钙活动，且新形成棘突的清除率也显著下降，幸存棘突也极少，与REMD的效果类似（Fig.5g-i）。这提示钙离子尖峰很可能参与了REM对新形成棘突的选择性修剪和强化过程。

由于8小时初次运动训练后，在1min的REM睡眠中爆发钙尖峰的树突有超过60%都在随后的4min再次训练（retrain）中再次爆发钙尖峰，且幅值相似（Fig.6a），作者推测，再次训练诱导的钙尖峰可能有与REM诱导的钙尖峰相似的生理作用。随后，作者观察到，再次训练可以缓解REMD造成的新棘突清除率下降，促进幸存棘突生长，且这种作用是钙活动依赖的（在再次训练前给予MK801，新棘突清除率下降；而在再次训练后给予MK801则不会。Fig.6b-c）。

为了明确究竟是钙活动的哪个环节影响的，作者使用KN-62（钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II (CaMK-II)抑制剂）进行干预，发现在给予KN-62后进行再次训练，新棘突的清除率和幸存棘突的生长都将被抑制，而钙尖峰的数量、峰值、峰值时间等都不受影响（Fig.e-j），提示REM调节突触可塑性的机制与NMDA受体及其细胞内钙信号通路有关，而不是通过钙尖峰的物理特性（如长时程增强LTP或长时程抑制LDP）。

▲ Fig.5

▲ Fig.6

• 本研究结果证实REM调整突触数量，既往研究表明NREM影响突触形成→这可能是REM在NREM之后发生的原因。

• REM调整新形成的突触数量以避免突触数量过负荷→可能与工作记忆的清除有关。

• REM 只调整近期新形成的突触数量，而对已强化的棘突没有影响→可能仅影响短期记忆的强化和回忆。

• REM调节突触可塑性的机制与Ca离子的胞内信号转导通路有关，而不是LTP/LFP等。

编  译：邱    越

排  版：施翔鹏

校  审：方    芳

            缪长虹