耳针降血压涉及自发性高血压大鼠肾上腺

背景：                   

交感神经系统可影响心输出量和外周血管阻力调节血压。交感神经活动增加会引起多动循环和外周血管收缩，导致高血压的产生。高血压经常与交感神经过度活动有关，这对靶器官有有害影响，也是心血管并发症的预测因素。此外，自主神经系统异常可以诱发，例如心动过速和肥胖，也是心血管疾病的危险因素。高血压是由于交感神经和副交感神经心血管调节紊乱；交感神经活动增加或迷走神经心脏张力降低导致高血压。因此，降低交感神经活动或增加副交感神经活动可作为控制高血压的靶点。                 

2.1. 动物。雄性SHR5至7周是从BioLASCO台湾有限公司购买的。大鼠在中国医科大学动物中心(CMU)饲养，光照/黑暗周期为12h。室温和湿度由空调控制在20-24°和湿度50%-70%。这些老鼠是自由喂养的，并提供了足够的饮用水。                   

动物使用得到了CMU机构动物护理和使用委员会的批准，并遵循了《实验动物使用指南》（国家科学院出版社)中的建议）。                                   

2.4. SHR 中 HR 和 BP 的 测 量。用 尾 凝 器 (LE5002，PanlabHarvard)在2%异氟醚气体麻醉下测定大鼠尾部HR和BP)。在耳廓EA治疗前后进行HR和BP的测量，时间为上午8：00。中午12：00。在测量之前，大鼠保持在28°用                  

热垫加热10min，可检测尾部动脉搏动。                  

本研究中BP和HR的值是三个测量值的平均值。                                   

2.5. 针灸治疗  不锈钢针灸针(在CO15和TEF3(TG)或Hx1和Hx2(SG)点中插入32G，Quian-Hui，新台北市，台湾；直径0.27毫米，长度13毫米。TEF3位于三角窝的顶端，位于上下两腿之间。Hx1位于螺旋上，低于螺旋结节，Hx2低于 Hx1。同侧CO15和TEF3是一对，Hx1和Hx2也是一对。这两对都连接到一个电刺激装置(Trio300，日本)。刺激的频率为2Hz。刺激强度为轻微可见抽动，治疗持续时间为20min。SHR接受治疗3次/周，持续3周，即10、11和12周。                   

大鼠在5%异氟醚深度麻醉下，在最终治疗完成后4h处死。                  

采集大鼠心脏、脑组织和肾上腺的血液。                                   

2.7. 实 验 2 ：证实耳电针降低BP引起的肾上腺GlandinS HR。10周龄大鼠，18例雄性SHR随机分为3组6组：正常组(NG)，不施加耳廓EA；EA组(EG)，大鼠在CO15和TEF3点接受2HzEA；双斜线组。在CO15和TEF3点，大鼠接受2HzEA，并在EA处理前30min将双三氯环线(GABA-A拮抗剂；1mg/kg溶于10%二甲基亚                  

砜(DMSO)99.5%+10%吐温20+80%蒸馏水或去离子水-DDW) 缓慢注入尾部。                  

耳穴EA治疗连续3周，即10周、11周和 12周。                  

在第三、第六和第九次治疗前后测量HR和BP。                  

大鼠在5%异氟醚气体麻醉下，在最后治疗后15min处死。                                   

2.8. 液相色谱-电喷雾电离-质谱分析。分析前，将50μL血清或肾上腺水提取物与200μL甲醇通过剧烈旋涡完全混合。样品在14000r pm离心10min，收集150μL上清液在35下干燥°在真空浓缩器中放置2h。将干燥的样品溶解在50μL超纯水中，通过监测m/z转变154到137和测量多巴胺和皮质醇水平                  使用XevoTQ-XS(Waters)通过ES+MRM模式分别达到363.2到 121 .06)。                   

其他神经递质用VIONIMSQ-Tof在丹斯酰化过程后测定。                  

液相色谱-电喷雾电离质谱(LC-EM-MS)分析如前所述检测肾上腺和血清中儿茶酚胺和神经递质的强度。                  

对于代谢物丹西化，在50mMNaHCO3，pH9.5中加入20μL20mg/mL丹西氯化物溶解样品。                  

混合物在70°时孵育2h，然后加入80μL的超纯水，混合液于70°温育持续30分钟。                  

在14000转/分钟离心10分钟后，将反应混合物的上清液转移到插入瓶中。                                     

流量设定为0.2mL/min，柱温为35°C.分离是用反相LC在BEHC18柱(2.1100mm，Walters)上进行的，样品注入量为7.5μL。                  

从99%流动相A（超纯水+0.1%甲酸）和99%流动相B（100%甲醇+0.1%甲酸）开始洗脱，在1%B处保持0.5min，在5.5min时提高到90%B，在90%B处保持1min，然后降低到1%B，保持1min。                  

通过抽1%B使柱平衡4min。                  

采用ESI+模式获得LC-ESI-MS色谱图，其方法如下：                  

2.5kv毛细管电压，100 °C源温度，脱溶温度250°保持锥形气体在10L/h，脱溶气体在600L/h，并由MS收购e 模式从 100 去 1000 m/z 还有 a 0.5 s 扫描 时间到了。                  

数据经分析过使用 UNIFI软件(Waters)有一个图示的色谱图，并总结在一个集成的信号区域。                  

结果是已提出作为a比率比较一下与控制老鼠。                

2.9. 数据准备和统计分析。所有数据采用SPSS软件对数据进行分析。显著差异进行分析。采用单向方差分析，然后采用Tukey检验（后自组织），然后                  进行混合模型分析，观察耳针EA和假EA在纵向治疗中对HR和BP的变化有何影响。                  

统计学意义在p<0.05时为有意义。                

3.1耳电针HR和BPinSHRs的作用  在CG、SG和TG（图）中，HR在基线(第一次耳EA治疗前)没有明显差异1(a))。在9次治疗中，SG和CG之间的HR没有显著差异，而TG中的HR低于第七次和第九次耳EA治疗前后的CG和SG(图 1(a))。这些结果表明，在CO15和TEF3处理后的耳EA可以降低SHR的HR。在基线时，各组之间的SBP也没有显著差异(图 1(b))。在第三和第四次治疗之前和第二、第三、第四和第八次治疗之后，SG中SBP低于CG(图 1(b))， 而在其他治疗时间，CG和SG之间没有显着性差异(图 1(b))；在每一次耳EA治疗前后，TG中SBP低于CG和SG(图 1(b))。在第一次或第二次、第四次或第五次治疗之前，SG和TG之间没有显着性差异(图 1(b)) 已确定。DBP在基线时也没有差别(图1(c))。在第一、第四、第九和第四、第七和第八次治疗之前，SG中的DBP低于CG(图 1(c))；否则，不存在显著差异(图 1(c))。在每次治疗前后，TG中的DBP低于CG和SG(图 1(c))，除了在第五次治疗之前，SG和TG之间没有显著差异(图 1(c))。                   

总之，在CO15和TEF3的耳EA可以立即降低SBP和DBP，而这些对Hx1的耳EA的影响Hx2很弱。                                   

3.3. 耳针刺对最终耳后4小时肾上腺皮质和血清神经递质的影响。在最后的耳廓EA治疗后4h，肾上腺的去甲肾上腺素，肾上腺素，多巴胺和可的松水平无明显差异在组中(图3(a))。虽然血清素水平在TG中高于CG(图 3(a))，它们在CG和SG之间或SG和TG之间没有显著差异(图3(a))。肾上腺的GABA水平在TG中高于CG和CG SG，而CG和SG之间的水平没有显著差异(图3(a)) 在最终                  

治疗后4小时。                  

血清去甲肾上腺素、肾上腺素、5-羟色胺和GABA水平在各组间无显着性差异。                  

治疗后4小时组(图3(b))。                  

综上所述，结果表明，在CO15和TEF3的耳EA可以提高肾上腺的5-羟色胺和GABA水平，而在Hx1和Hx2的耳EA不能产生类似的效果。                 

结果还表明，SBP仅在第三和第四次治疗前后和第二和第八次治疗后与CG相比在SG中较低。与CG相比，DBP仅在第四、第七和第八次治疗之前和第一、第四和第九次治疗之后才降低。除第五次治疗前外，TG中的SBP和DBP均低于CG和SG，而TG中的SBP和DBP在SG中相似。这些结果表明，在CO15和TEF时耳电刺激能降低血压，治疗与治疗时间之间的相互作用是显著的。此外，我们的结果表明，在TG中腹腔神经丛最终耳电刺激治疗后4h，肾上腺                  GABA水平升高。                  

一些研究表明，迷走神经可以通过迷走神经传出连接改变肾上腺激素。                  

神经系统与迷走神经背运动核之间的相互作用将迷走神经传入信号与传入信号联系起来。                  

迷走神经传出纤维从迷走神经的DMN中也支配神经节，这可能是这些节后儿茶酚胺能纤维的起源。                  

肾上腺也由含有节前交感纤维的腹腔神经节支配。                   

一些研究报告说，口服或静脉注射GABA可以降低动物和人类的血压。                  

口服GABA可显著降低SHRs中的 SPB，而Wistar-Kyoto大鼠（正常致盲大鼠)则不显著）。                  

摄入含有GABA的牛奶可降低轻度高血压患者的血压。                  

GABA已在各种内分泌器官中被鉴定，它是由肾上腺皮质类固醇产生细胞合成和储存的。                  

GABA以旁分泌方式通过GABA-A受体调节肾上腺髓质儿茶酚胺的释放。                  

松冈等 人证明GABA对肾上腺髓质细胞经突触诱导的兴奋性增加有抑制作用。                  

他们认为GABA-A受体刺激会减少儿茶酚胺分泌的总量。             

原田等人确定GABA在调节儿茶酚胺的分泌方面具有双重作用，因为它在低水平上增强了它的释放，并在高水平上减少了它。                  

此外，在肾上腺髓质中，GABA在肾上腺嗜铬细胞中合成，储存在嗜铬颗粒中，并在烟碱乙酰胆碱受体激活后释放, 迷走神经支配肾上腺髓质。                  我们的结果还表明，血清去甲肾上腺素和肾上腺素水平在EG(耳EA在CO15和TEF3)和BG低于NG在15分钟后，但GABA水平的肾上腺增加TG(耳EA在CO15和TEF3)在4h后，最终治疗。                  

因此，血清中去甲肾上腺素和肾上腺素的降低与GABA抑制剂的使用无关，与肾上腺中GABA 水平无关。                  

肾上腺GABA水平的升高可能是耳EA在CO15和TEF3的延迟效应。                  

GABA是γ-氨基丁酸，一种重要的抑制性神经递质，参与多种代谢活动。                  

GABA能作用于脊髓的血管运动中心，有效促进血管扩张达到降低血压的目的。                  

研究发现，GABA还能抑制抗利尿激素的分泌，有效促进血管扩张，从而降低BP。                  

其他专家发现GABA及其代谢物对血管紧张素转换酶的活性有很强的抑制作用。                  

这表明GABA不仅通过抑制肾上腺髓质中儿茶酚胺的释放，而且通过其他手段产生降压作用。