核酸知识系列（二）

核酸分为DNA和RNA，将其从临床标本中提取出来，是进行PCR检测的前提，应该说DNA和RNA提取的基本思路是相同的，但由于其对标本及处理中影响因素的敏感性的差异，在具体的提取步骤或注意事项上，仍有一定的不同。

从成分复杂的临床标本中，将核酸提取纯化除了，其目的注意有以下几点：

1，除去PCR抑制物；

2，增加靶核苷酸浓度，使其能达到特定PCR的测定范围；

3，增加样本的均一性，以保证测定的精密度和重复性。

cfDNA抽提，对血浆分离有什么要求？

全血中血浆和血清均能分离出cfDNA，但研究显示，相对于血清标本，血浆中cfDNA有更高的检出率，所以临床一般建议分离出血浆进行cfDNA的抽提。血浆量越多所提取的DNA量就越多，其中含有的cfDNA量就越多，对检测越有利，所以临床一般建议采集10ml全血（4~5ml血浆），采集完成后需温柔颠倒混匀，以便于抗凝剂或保护剂充分与血液接触。

根据检测的时效性，分离血浆一般有两种采集管的选择方案：

一、EDTA抗凝管：

用常规EDTA抗凝管采集全血后，为防止游离DNA的降解，避免野生型DNA背景的增加，建议两小时内以足够的离心力将全血充分低温离心两次，分离出不含细胞成分的血浆（离心前临时保存应暂放于2~8℃冷藏，离心也建议4度离心）。

一般建议4度保存，离心，这样不容易溶血。室温（37℃）可能会使血液里的微量成分降解及溶血，其次室温（37℃）高速离心时，旋转会变热，使得酶之类对温度敏感的成分失效破坏。如果条件不允许，没有4℃离心机，短时间内（2h内）室温离心也是可以的。

二、Streck采血管：

一般条件允许（资金充裕）可以使用Streck管，毕竟进口的，质量还是有所保障的；如果条件不允许（资金不足），可以使用含有游离DNA保护剂及防细胞裂解保护剂的国产专用常温采血管。采集后轻摇混匀，常温（6~37℃）放置不超过3-7天，以足够的离心力将全血充分离心两次，分离出不含细胞成分的血浆，常温离心就可以。

血浆分离的步骤

不管是用EDTA采血管还是Streck采血管，采集满10ml全血后，分离的步骤都是一样的（离心温度可能有差异，影响不是很大）。

首先，1600g 离心10分钟，离心结束后轻缓地将采血管取出，参照下图，若出现严重溶血和脂血，则不建议进行后续实验；

如发生严重溶血，标本不可用，血红蛋白及其代谢产物可能抑制Taq酶活性，使PCR扩增效率明显降低

血脂过高，使血浆呈乳白色，低密度脂蛋白对荧光有屏蔽和吸收作用，故对PCR有干扰

其次，将上清血浆转移至准备好的2 mL灭菌离心管中，避免吸取过程中吸到白膜层。把装有血浆的2mL离心管进行第二次离心，16000 × g 离心10 min；

最后，把离心后的上清液转移到新的2 mL灭菌离心管中，注意不要吸到沉淀，2 mL灭菌离心管中血浆量不能超过2/3，因为冷冻保存时候体积变大，导致管盖打开或者管子破碎。

市场上，一般抽提cfDNA时候都会加入Carrier RNA，加和不加影响其实蛮大的，也有些公司说试剂盒优化了，无需加入Carrier RNA，也可以达到很好的回收率，那么carrier RNA到底有什么用呢？

Carrier RNA在试剂盒中主要用来针对微量样本提取核酸时，帮助高效回收核酸的作用。其次，如果抽提使用的EP管是非低吸附的，那么管壁上会有静电，会吸附核酸，在提取纯化过程中采用Carrier RNA可帮助核酸去除静电效应，能很好被吸附到纯化柱上，可提高洗脱效率，从而达到尽可能大的回收样本中核酸。

cfDNA一般只有几十ng，那么这些DNA离心沉淀的时候，沉淀的DNA是无法用肉眼观察到的，这时候可以加点DNA的共沉淀剂，这些共沉淀剂是跟DNA不能发生任何反应的，也是没有相互干扰的，然后他们沉下来的时候是一团（一层）在管底，根据这个管底是否有你加的共沉淀剂你可以做出判断你的目标DNA是否沉淀下来了，carrier RNA可以起到指示剂的作用，通过它来间接判断目标DNA或者RNA的提取情况。