文献精读 | 长时间记忆的基础：Fos神经网络的双向抑制可塑性

在大脑中，神经元将获得的体验转化为稳定的记忆来指导未来的行为活动。大量研究表明，散在分布于多个脑区的神经元是许多行为的物质基础。这些神经活动的特征之一是一系列基因的一过性表达，被命名为“即早基因”。其中，对这些基因编码的FOS转录因子长期以来存在如下假设：表达Fos的神经元被外界刺激激活后立即进行修订，易化针对这一刺激某些特征的编码过程，从而达到少量相关神经元被重新激活，即可达到细节化回忆相关刺激的目的。然而在这一过程中，神经元是否存在永久修饰以及其中潜在的机制目前仍是未解之谜。此外，目前尚不清楚Fos除了作为神经元激活的标志以外，是否还能协调神经环路修订，以利于编码这些体验。

      此前有研究证明，海马CA1区Fos阳性神经元可对环境信息进行稳定编码。由于CA1中的反复发生的兴奋性连接较弱，锥体细胞（pyramidal cell, PC）被认为主要受兴奋性输入信号或者区域性中间神经元（interneuron, IN）的调控。IN依靠延伸的轴突分支靶向作用于PC，调控锥体细胞群放电的频率和持续时间。有研究表明，表达微清蛋白（parvalbumin, PV）和胆囊收缩素（CCK, cholecystokinin）的IN对PC有不同抑制功能：PV-IN放电模式为快速非适应性，主要以前馈抑制的形式被激活；CCK-IN放电模式为常规适应性，主要以反馈抑制的模式被激活。这些抑制信号共同协调行为依赖的网络震荡，例如：PV-IN可通过调控γ节律来影响PC的瞬时同步化；PV-IN和CCK-IN在θ节律的不同时期放电，促进记忆编码和提取。基于以上背景，作者推断可以从主体体验改变网络功能的时间动力学机制着手来研究长时间记忆。

本研究使用腺病毒（AAV）方法使近期被激活的神经元表达mKate2荧光蛋白。将放置于新环境的小鼠与标准环境中的对照组小鼠相比，大脑中mKate2+神经元的数量显著增加，表明此方法可用于探究FOS的长时间效应及其晚期应答靶基因（通常在刺激发生1-12h后被激活）。

    作者通过使用光遗传学方法，用Cre依赖的AAV在PVCre小鼠CA1区PV-IN中特异性表达ChR2，将小鼠放置于新环境2-3天后，制作急性海马切片，光激活PV-IN后使用双重全细胞膜片钳技术，成对记录FOS+mKate2+和FOS-mKate2-的PC中的抑制性突触后电位（PV-IPSC）。结果显示，无论是否放置于新环境，FOS+mKate2+神经元中PV-IPSC的振幅均显著高于FOS-mKate2-神经元，这表明PV-IN对Fos激活的海马CA1锥体神经元的抑制作用更强。

   类似的，作者使用Flp和Cre依赖的AAV在Dlx5/6Flp;CCKCre小鼠CA1区CCK-IN中特异性表达ChR2，光激活CCK-IN后，显示出与PV-IN相反的结果——CCK-IN的抑制作用在Fos激活的CA1区PC中减弱。

     化学遗传学方法也验证了上述结果。

      因此，当小鼠在新环境中探索时，不同亚型IN对表达Fos的神经元有选择性的产生持续的双向改变：PV-IN输入的抑制性信号增强，而CCK-IN输入的抑制性信号减弱。本文中将这种现象定义为“双向抑制作用”。

▲ 图1

由于这种双向抑制作用仅在表达Fos的CA1 PC中出现，推测Fos家族转录因子可能在其中发挥重要作用。RNA测序结果显示，Fos、Fosb和Junb三种Fos家族转录因子在激活神经元中的表达量显著提高。因此作者构建了Fosfl/fl ;Fosbfl/fl ;Junbfl/fl（FFJ）小鼠，达到时空性调控AP-1因子表达的效果。用表达Cre的AAV在海马CA1 PC中零星删除这三种转录因子（FFJ-KO），然后电刺激IN轴突，记录未敲除FFJ的细胞（FFJ-WT）和相邻FFJ-KO细胞的电生理变化。结果显示，CA1区FFJ-KO神经元IPSC振幅显著低于FFJ-WT神经元，然而接受到的CA3区兴奋性输入引起的兴奋性突触后电位无明显变化。这表明FOS转录因子复合物AP-1特异性地对抑制信号产生调控。

    为了直接检测抑制水平变化，作者构建了PVFlp/Flp;FFJ小鼠。用光遗传学方法激活PV-IN后，标准环境中小鼠的FFJ-WT细胞和相邻FFJ-KO细胞中的IPSC无明显差异；放置于新环境7-10日后，FFJ-KO细胞的IPSC振幅显著降低。这表明FOS对于体验诱导的PV抑制必不可少，同时也揭示了AP-1在长期可塑性中可能存在尚未认知的作用。

    对FFJ小鼠双侧CA1区注射表达正常Cre（FFJ-KO）或失活Cre（FFI-KO）的AAV，来探究AP-1缺失引起的抑制功能受损是否导致记忆缺陷。Morris水迷宫结果显示，FFJ-KO小鼠的空间学习和记忆功能受损，然而运动功能无明显变化，表明Fos的确参与了记忆的形成。

    综上所述，Fos激活的神经网络的可塑性可能对海马依赖性的空间学习能力具有重要的支持作用。

▲ 图2

    为了探究AP-1作用机制及下游靶点，作者使用单细胞RNA测序、核糖体相关mRNA谱分析以及核酸酶靶向切割和释放（CUT&RUN）技术，筛选满足以下条件的基因：（1）CA1 PC；（2）当AP-1功能受损时，表达量下降；（3）在FOS附近的调控DNA元件上，与FOS的结合与激活相关。文章筛选出Inhba、Bdnf、Scg2、Rgs2、Nptx2和Pcsk1六个基因上。用sh-RNA在CA1 PC中分别敲减这六个基因后，PV介导的抑制仅在敲减Scg2的PC中显著下降，表明Scg2在PV抑制的长期调控中发挥重要作用。

    此前有研究表明，Scg2受活动调控，编码多个不同的神经肽，然而这些神经肽在大脑内的功能仍不清楚。为了检测CA1区Scg2的表达是否依赖于个体的体验，作者用单分子原位杂交的方法检测放置于新环境6h和放置于标准环境小鼠的Fos和Scg2表达，结果显示前者CA1锥体神经元中Fos和Scg2表达均显著提高，且即使短时间放置（5-min）也能在1h或6h后检测到Fos和Scg2 表达升高。因此，Scg2 可能是FOS在CA1锥体神经元中调控抑制作用的重要靶点。

▲ 图3

▲ 图4

    为了进一步研究Scg2在双向抑制可塑性中的作用，研究者构建了Scg2fl/fl; PVFlp/Flp小鼠（条件性敲除）。然后将小鼠放置于新环境中2-3天，用光遗传学技术激活PV，并记录周围敲除Scg2和未敲除Scg2的神经元的电生理变化。在Fos被激活神经元中，敲除Scg2的细胞PV-IPSC振幅显著小于未敲除Scg2的细胞。然而在Fos未被激活神经元中，无论是否放置于新环境，敲除Scg2均对IPSC振幅无明显影响。

    随后，研究Scg2对CCK介导的抑制是否也具有调控作用。使用Scg2fl/fl小鼠，然后通过ω-agatoxin IVA特异性阻断PV-IPSC来选择性检测CCK-IPSC，得到与PV抑制相反的结果：在敲除Scg2的Fos+神经元中，CCK-IPSC振幅显著提高，即抑制效果增强。因此，AP-1通过作用于Scg2，将PV-和CCK-介导的，对Fos+神经元的双向调节偶联起来。在随后的rescue和过表达实验中，作者通过AAV引入外源SCG2，使敲除Scg2的Fos激活神经元的IPSC恢复至正常水平，进一步验证了这一观点。

    既往研究表明，SCG2前体被酶切后产生多种具有潜在功能的神经肽。通过点突变的方式，研究者构建了抗切割的SCG2，在验证了SCG2表达水平不受影响后，在敲除Scg2的Fos+神经元中进行过表达实验，结果显示抗切割的SCG2不能使IPSC恢复正常水平。因此，Scg2前体切割形成的成熟神经肽可能在记忆依赖的双向抑制可塑性中发挥关键作用，共同调控抑制信号。

▲ 图5

    最后，作者明确了FOS-SG2通路是否改变海马的神经网络功能。将表达Cre的AAV注射至Scg2fl/fl小鼠的双侧CA1区来沉默Scg2，然后在清醒且头部固定情况下记录海马锥体神经元的电活动。结果显示，在Scg2缺失情况下，海马γ节律发生变化，主要表现为快γ波（60-90Hz）功率下降；而θ节律（4-12Hz）和平均放电率无明显变化。此前有研究表明，PV-IN和CCK-IN分别在θ振荡的下降和上升阶段触发。作者观察到Scg2-KO细胞更倾向于在θ波上升阶段放电，而Scg2-WT细胞更倾向于在在θ波下降阶段放电，这与预期的Scg2缺失后PV-IN和CCK-IN输入平衡的变化一致。因此，Scg2基因沉默导致小鼠与学习和记忆有关的脑电波发生变化。

▲ 图6

Fos激活的神经网络广泛分布于许多脑区，这些网络被不断修饰以支持长期记忆的形成及巩固，然而其中的环路和分子机制仍鲜为人知。此外，目前尚不清楚FOS是否在调控神经环路的修饰中发挥因果作用，以及作用的靶点。本文揭示了Fos神经网络的双向抑制可塑性机制，该机制介导了Fos神经网络对行为体验产生应答并发生选择性重组，FOS-SCG2通路对于这种重组至关重要。这可能是神经网络编码和唤起记忆的重要基石。

编  译：梁昕悦