【基础知识】什么，你都还不懂测序？（2）第二代测序

                正文                 

      第二代测序，又称下一代测序（Next-generation sequencing，NGS）。简单说来，第二代测序是依赖于PCR文库构建、激光探头读取荧光信号的短读长测序。目前最常见的平台包括Illumina和BGI（华大基因），所以在本文中我们主要就介绍这两个平台的测序原理。同时，基于二代的10X linked-read测序是对二代技术的改进，略作讲解。

1. Illumina：边合成边测序（Sequencing by Synthesis）

        原理基于PCR，当在Flowcell中加入不同荧光标记的dNTP（区分ATGC）和酶，由引物起始开始合成子链。但是dNTP存在 3’端叠氮基团会阻碍子链延伸，这使得每个循环只能测得一个碱基。合成完一个碱基后， Flowcell 通入液体洗掉多余的dNTP和酶，使用显微镜的激光扫描特征荧光信号。

      整个过程包含样本制备（Sample Prep）、成簇（Cluster generation）、测序（Sequencing）等步骤，每步的具体方法不多说，可以看看视频大概了解一些。

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视频材料1：Illumina边合成边测序原理视频

2. BGI：联合探针锚定聚合技术（cPAS）和改进的DNA纳米球（DNB）核心测序技术

        单链DNA会缠绕成一个纳米球，纳米球可自动附着于有整齐的固定点的芯片上而不相互堆叠（即阵列技术），随后利用组合探针锚定连接法测序。

        整个过程包含样本准备（形成末端修复的DNA片段）、片段扩增（加接头序列、形成单链DNA、成环、滚环扩增形成DNA纳米球）、纳米球附着于芯片并使用cPAS法测序。具体原理参见文献：Science 327, 78 (2010)。[1]

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视频材料2：BGI cPAS-DNB测序原理视频

3. Illumina和BGI比较

BGISEQ500和Illumina NEXTSEQ500对比[2]

4. 二代测序技术与一代测序技术的比较

    一代：准确性高（~0.1%ER）、读长较长（~1kb）、通量低、价格昂贵。

    二代：准确性较高（1~1.5%ER）、读长较长（150~600bp）、通量高、价格便宜。

5. UPDATED 2ND SEQUENCING: 10X GENOMICS LINKED READS

        10X是通过改善建库流程，对同一HMW DNA模板加Barcode后分到不同的液滴，将每个液滴中的DNA分子打断后测序，随后再组装，从而通过二代测序技术对小片段测序后组成成长片段（linked reads）。参见Nat Biotechnol. 2016 March ; 34(3): 303–311。[3]

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10X linked-read sequencing技术

6. 二代测序的不足

 （1）片段长度：由于是基于PCR，随着PCR反应的进行，测序错误不断积累，这也是限制二代测序检测长片段的原因。10X linked-read sequencing具备用短片段组成长片段的优势，但同时也具备整个二代测序所拥有的劣势，那就是GC偏好性。

（2）仪器造价昂贵：荧光标记核苷酸，通过检测荧光信号可以可以判读碱基的类型，准确率也很高。但是，荧光信号的检测依赖于光学组件，这大大提高了仪器的造价。这也是为何Nanopore测序技术仪器造价相对较低的原因（不检测光信号，检测电信号）。

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【基础知识】什么，你都还不懂测序？（1）Sanger测序法

                参考                 

[1] Science, 2010, 327, 78. DOI: 10.1126/science.1181498

[2] https://www.zhihu.com/question/36826420

[3] Nat Biotechnol. 2016 March ; 34(3): 303–311. doi:10.1038/nbt.3432.

                后记                 

随着测序技术的不断发展，科学研究进入了数据井喷的时代。然而，测序样本的处理流程、测序数据的分析流程甚至是数据分析过程中的数据库搭建问题，都给测序技术的普及化设置了壁垒，严重阻碍了该项技术向广大科研工作者中推广。此外，基于长读长的三代测序技术的发展更是引入了一套完全有别于二代测序数据处理的分析流程，为了让更多学者认识三代测序、在科学研究中用好三代测序，本公众号应运而生。期待与您一起学习、成长。