抗原联合“1+1>2”,风疹病毒棘突蛋白(E1-E2)现身说法!

2021
01/18

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在免疫诊断产品的开发中,研发人员会发现,两种抗原联合使用,有时候会收获意想不到的效果。比如,原料A的灵敏度较好,但是特异性不尽人意,而原料B刚好相反。这时,原料A和原料B混合使用,调试用量比例后,则有可能获得理想的灵敏度与特异性。当然,原料混合使用这种做法并不常见。一方面,使用两种抗原可能会增加成本,另一方面,多一种抗原就是多一个变量,带给产品CV更大的挑战。
当然,也存在例外。在重组蛋白中,两种或多种蛋白联合表达,蛋白质形成聚合物,以一个整体用于诊断试剂,效果往往较出色!
下面,就以风疹病毒棘突蛋白(E1-E2)为例,现身说法,阐述其中缘由。


 

 

风疹病毒的发现及检测


 

 

首先,先介绍主角——风疹病毒(Rubella virusRV)。
18世纪中叶,由风疹病毒引起的风疹首次被两名德国医生发现。起初,风疹被认为是一种儿童轻度传染疾病。1941年,澳大利亚的眼科医生Norman McAlister Gregg注意到,患有先天性白内障的婴儿也患有先天性心脏病。这些婴儿的大多数母亲在怀孕的头三个月就感染了风疹。他首次将风疹的发生与婴儿的遗传缺陷相关联。后来,其他科学家也观察到类似情况。
经过科学家多年的潜心研究,现在我们知道,如果怀孕的母亲在怀孕的前20周内感染风疹病毒,病毒会通过胎盘屏障,进而感染胎儿,可能导致流产。风疹感染最严重的影响是其先天性致畸性,包括失明、耳聋、先天性心脏病、智力低下和神经系统并发症,所有这些统称为统称先天性风疹综合症(Congenital rubella syndromeCRS)。
WHO统计,全世界每年有超过100000名先天性风疹综合症婴儿出生。
由于CRS的严重危害性,很多国家/地区出台相关政策,以图消除风疹病毒感染带来的影响。其中,孕前筛查就是预防工作的重要一环。
(1)中国,《孕前TORCH 筛查专家共识(2019版)》明确:同时检测血清特异性IgG和IgM,判断感染状态。如果孕前血清IgG 水平<10-15 IU/mL,则孕期不足以抵抗风疹病毒对胎儿的影响。
(2)WHO,《Manual for the laboratory diagnosis of measles and rubella virus infection》提出:大约50%的风疹病毒感染是亚临床,症状轻微,需要通过检测手段才能确认。急性期与恢复期双份血清特异性IgG的抗体滴度4倍升高,可确诊感染。特异性IgM检测最常用于判断近期感染。
(3)美国CDC,《Prevention of Measles, Rubella, Congenital Rubella Syndrome, and Mumps,2013: Summary Recommendations of the Advisory Committee on ImmunizationPractices (ACIP)》指出:收集血清的最佳时间点是在症状(发烧和出疹子)发作后第五天,特异性IgM的检测可以提供当前或最近的风疹病毒感染的推测证据。考虑IgM检测出现假阳性的风险,用特异性IgG亲和力检测作为辅助,判断近期感染或既往感染。
小结:
风疹病毒感染的危害较严重,而孕前筛查可以有效降低其影响。免疫检测作为常规有效的实验室检测手段,已被世界各地推举且已应用到具体的预防工作中。具体的,特异性IgGIgM联合检测可以作为感染状态的判断依据。IgG抗体亲和力是血清学检测的有效补充。当然,预防效果依赖于免疫检测结果的准确性。在技术层面,选择风疹病毒的哪种蛋白,可以最大限度保证诊断试剂的高性能呢?
接下来,我们从蛋白质组学角度聊聊风疹病毒。

 

 

风疹病毒的蛋白质组学


 

   
风疹病毒是一种正义单链RNA病毒,呈球形,约40-80nm,基因组约9.7 kb。风疹病毒仅编码5种蛋白质,如图1。其基因组由两个非重叠ORF组成,5'ORF表达非结构蛋白,3'ORF表达结构蛋白。
图1:风疹病毒结构及基因组
其中,结构蛋白有3种,包括:E158 kDa)、E242-47 kDa)和核衣壳蛋白C33 kDa)。E1E2是引起宿主免疫应答的主要靶抗原。有研究表明,核衣壳蛋白C与人体内的髓磷脂碱性蛋白的序列相似,在体外诊断中可引起交叉反应。因此,在风疹病毒的诊断原料选择中,常常把重心放在E1E2上。
风疹病毒E1E2属于糖蛋白。在微观结构中,E1E2是以异二聚体形式存在,从病毒突出形成6-8 nm的表面尖峰。两者的相对位置是,E1构型扩展且在棘突复合体的底部带有E2E1分子更多地暴露在E2的表面上。如2,风疹病毒的表面特征是倾向于形成四到六行平行的糖蛋白组。在拉长的病毒体中(图2A),糖蛋白行以螺旋模式缠绕在病毒体周围,终止于病毒体末端附近。这些糖蛋白结合并形成一个封闭的外壳。
概括讲,在风疹病毒体上E1E2合,以多聚体形式存在,两者在空间上有较紧密的联系。
图2:风疹病毒E1-E2多聚体微观结构
 

我们知道,同一个蛋白质,以单独形式存在和以聚合物形式存在,两种蛋白构象是有差异的。蛋白质的空间构象改变,会导致一部分抗原表位消失,同时也会产生一些新的抗原表位。E1和E2以单独形式存在时,其提供的抗原表位种类,肯定部分不同于E1-E2异二聚体。

风疹病毒的E1和E2以异二聚体的形式存在。在免疫应答中,E1-E2异二聚体是作为一个整体被抗原提呈细胞溶解、呈递,诱导产生特异性抗体。因为抗原表位差异,E1-E2异二聚体诱导所产生的抗体中,有部分是E1或E2单体所不能识别。

因抗原表位不同而带来的检测偏差,有可能影响临床判断,诸如IgM抗体检测、IgG抗体亲和力检测等。因此,在风疹病毒抗体检测中,使用E1-E2异二聚体最为包被原,最大程度提供正确的抗原表位,是非常有必要的。

   
此外,有研究表明,E1与E2蛋白诱导免疫应答产生IgG的时间不完全重合。如图3。因此,可同时使用E1和E2用于免疫诊断,提高检测的灵敏度。
图3:风疹病毒感染后的免疫应答随时间变化
小结:
风疹病毒的E1和E2蛋白是激发机体产生免疫应答的主要蛋白。在天然病毒体中,E1和E2相互作用以异二聚体的形式存在,共同诱导机体产生抗体。同一个蛋白质,以单独形式存在和以异二聚体形式存在,两种蛋白构象是有差异,提供的抗原表位也不同。因此,E1-E2异二聚体诱导所产生的抗体中,有部分是E1或E2单体所不能识别。此外,衣壳蛋白C因为与髓磷脂碱性蛋白的同源性,存在交叉反应的风险,因此较少用于临床诊断。
总结:
风疹病毒的抗体检测是孕前筛查、预防先天性风疹综合症的重要一环。因为风疹病毒核衣壳蛋白C与人体髓磷脂碱性蛋白存在同源性,因此在临床诊断中,天然全抗原或核衣壳蛋白C存在交叉反应的风险,并非理想选择。
E1和E2是刺激机体产生免疫应答的主要蛋白,因此是检测抗体的主要原料。如上所述,蛋白构象不同导致抗原表位差异。风疹病毒的E1和E2是以异二聚体形式存在,其刺激人体产生的抗体,可能部分不能与E1或E2单体特异性结合。而重组蛋白E1-E2异二聚体经表达系统修饰,可以最大限度还原蛋白构象,提供正确且丰富的抗原表位,确保检测结果的准确性。
E1-E2异二聚体用于检测试剂,可以有效加成E1和E2单体的特异性抗体。同时蛋白构象更加接近天然,是E1和E2单体所不具备。因此说,E1-E2异二聚体可以实现“1+1>2”的效果。
 

 

 

SERION 风疹病毒抗原(E1-E2)


 

 

维润赛润推出风疹病毒棘突蛋白(E1-E2,采用昆虫表达系统,以满足糖基化修饰要求。蛋白E1-E2异二聚体的形式存在,接近天然状态的蛋白构象,提供正确且丰富的抗原表位,可有效提高检测试剂的性能!
产品:Rubella Spike Ectodomain (E1-E2)
货号:BA129R01

参考文献(略):

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关键词:
现身说法,风疹病毒棘突,蛋白,风疹病毒,E2,异二聚体,E1

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