Cell：相生相克，内源sgRNA能够下调CRISPR系统表达

2021-01-13 生物世界

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CRISPR簇 是一个广泛存在于细菌和古菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，充当了 防御外源遗传物质的“基因武器” 。 CRISPR全称Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats—成簇的规律间隔的短回文重复序列，分布在40%的已测序细菌和90%的已测序古细菌当中。

其中，CRISPR序列由众多短而保守的重复序列区（repeat）和间隔区（spacer）组成。重复序列区含有回文序列，可以形成发卡结构。而间隔区比较特殊，它们是被细菌俘获的外源DNA序列。这就相当于细菌免疫系统的“黑名单”，当这些外源遗传物质再次入侵时，CRISPR/Cas系统就会予以精确打击。而在上游的前导区（leader）被认为是CRISPR序列的启动子。另外，在上游还有一个多态性的家族基因，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用。因此，该基因被命名为CRISPR关联基因 （CRISPR associated，Cas）。Cas基因与CRISPR序列共同进化，形成了在细菌中高度保守的CRISPR/Cas系统。

CRISPR免疫分为三个阶段。在第一个阶段中，当噬菌体病毒首次入侵宿主细菌，病毒的双链DNA被注入细胞内部。CRISPR/Cas系统会从这段外源DNA中截取一段序列作为外源DNA的“身份证”，然后将其作为新的间隔序列被整合到基因组的CRISPR序列之中。因此，这段与间隔序列对应的“身份证”被称为原间隔序列（protospacer）。然而，“身份证”的选取并不是随机的。原间隔序列向两端延伸的几个碱基都十分保守，被称为原间隔序列临近基序 （protospacer adjacent motif，PAM）（图2）。

第二阶段，当病毒再次入侵，CRISPR序列会在前导区的调控下转录出pre-CRISPR-derived RNA (pre-crRNA）和trans-acting crRNA （tracrRNA）。其中，tracrRNA是由重复序列区转录而成的具有发卡结构的RNA，而pre-crRNA是由整个CRISPR序列转录而成的大型RNA分子。随后，pre-crRNA，tracrRNA以及Cas9编码的蛋白将会组装成一个小型“兵工厂”。它将根据入侵者的类型，选取对应的“身份证” （间隔序列RNA），并在RNase Ⅲ的协助下对这段间“身份证”进行剪切，最终形成一段短小的crRNA （包含单一种类的间隔序列RNA以及部分重复序列区）。crRNA，Cas9以及tracrRNA组成的复合物，就是最终的“战斗武器” （图3）。

最后，在第三阶段“靶向干扰”过程中（图4），Cas9/tracrRNA/crRNA复合物就像是一枚制导导弹，可以对入侵者的DNA进行精确的打击。这个复合物将扫描整个外源DNA序列，并识别出与crRNA互补的原间隔序列。这时，复合物将定位到PAM/原间隔序列的区域，DNA双链将被解开，形成R-Loop。crRNA将与互补链杂交，而另一条链则保持游离状态。随后，Cas9蛋白HNH酶活性将剪切crRNA互补的DNA链，而其RuvC活性位点将剪切非互补链。最终，Cas9强大的火力使双链断裂（DSB）形成，外源DNA的表达被沉默。

重要的是，所有免疫系统正确地发挥作用必须区分“自我”和“非自我”部分，需要在提供针对各种病原体相关抗原的有效活性同时，避免引起自身免疫反应。然而，CRISPR-Cas免疫系统在其单细胞宿主内是如何调节免疫强度的目前还不清楚。一些研究也表明，CRISPR-Cas的表达可受到包括噬菌体感染，膜应力，代谢状态等因素的调节。在某些情况下，位于CRISPR-Cas位点之外的转录因子可以与CRISPR-Cas启动子相互作用达到调控CRISPR-Cas表达的目的。尽管如此，针对Ⅱ-型CRISPR-Cas系统的转录因子却很少发现。

2021年1月8日，美国约翰・霍普金斯大学医学院 Joshua W. Modell 团队在 Cell 杂志上发表了题为： A natural single-guide RNA repurposes Cas9 to autoregulate CRISPR-Cas expression 的研究论文，研究人员发现， 细菌可编码内源 sgRNA-tracr-L，直接使用 Cas9 蛋白下调 CRISPR-Cas 系统表达 。

如上文所介绍的，除了前crRNA外，化脓链球菌CRISPR-Cas系统还含有第二种非编码RNA，tracrRNA，在CRISPR免疫的所有三个阶段发挥作用，tracrRNA由两个产生长（tracr-L）和短（tracr-S）形式的启动子转录而来，这两种启动子都含有RNAseII加工位点。tracr-S目前已有研究，但目前尚不清楚tracr-L的作用是什么，也不清楚为什么会产生两种形式的tracrRNA。

为了弄清tracr-L的作用，作者利用一个 tracrRNA 突变体进行研究，结果发现tracr-L突变后能够增强宿主对噬菌体的抗性 （图5）。