术后认知功能障碍系列之一：沉默SP1可通过胆碱能抗炎途径减轻七氟烷诱导的术后认知功能障碍

2021-01-05 古麻今醉

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研究背景

术后认知功能障碍(POCD)是一种中枢神经系统并发症，主要表现为手术/麻醉过程中，患者的记忆、注意力下降并伴随人格方面的改变。

七氟烷作为吸入性麻醉药的代表，广泛应用于婴幼儿麻醉。但是，越来越多的研究表明：七氟烷可以促进神经系统的炎症反应并诱导细胞凋亡，这与POCD的发生密切相关。因此，探讨在POCD中，七氟烷诱发炎症和凋亡的潜在机制至关重要。

特异性蛋白1(SP1)是一种参与多种细胞过程的重要转录因子，其结构含有一个C2H2锌指，具有广泛的表达。根据对AD患者的调查，发现SP1是脑部炎症反应的诱导剂。此外，姚等人提出抑制SP1可促进细胞凋亡，对帕金森病模型有明显的保护作用。以上提示SP1在神经退行性疾病的发生发展中起重要作用。然而，目前没有研究证实SP1在POCD中的作用。

最初，胆碱能抗炎途径(CAP)是在探讨迷走神经传出在调节内毒素刺激的炎症反应中的作用时提出的。以往的研究表明，迷走神经可以在刺激下向大脑传递信号，反之，迷走神经释放的乙酰胆碱可以与效应细胞的表面受体α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)结合，从而引起炎症反应。此外，α7nAChR还被证实与大鼠神经元的促炎因子表达和神经炎症有关。已有研究表明：激活α7nAChR可以改善POCD和肠道损伤。因此，CAP可能在POCD的发生发展过程中起着重要的调节作用。

综上，本研究以七氟烷诱导的Sprague-Dawley大鼠和原代培养的海马神经元为基础，建立了POCD的体内和体外模型，以验证SP1和CAP在POCD发病过程中对神经炎症和细胞凋亡的影响。

方法

实验动物：3周龄Sprague Dawley大鼠，体重约50g；

实验分组：对照组，2h七氟烷麻醉组，5h七氟烷麻醉组；

体外POCD模型：原代神经元培养，应用七氟烷14天；

认知功能检测：Morris水迷宫对大鼠的认知功能进行检测；

q-PCR和蛋白质免疫印迹对海马组织及海马神经元的SP1和α7nAChR进行检测；

Elisa进行血清炎症因子的检测。

结果

1.七氟烷麻醉会损害大鼠的认知能力。

为了验证七氟烷是否会诱导大鼠发生POCD，我们使用Morris水迷宫测试检查了七氟烷麻醉下大鼠的认知功能。七氟烷麻醉下的大鼠逃逸潜伏期更长，测试阶段在目标象限中花费的时间更短（图1a，b）。在测试中七氟烷麻醉还显著延长了大鼠的穿行路径，减少了穿越平台所花费的时间（图1c，d）。此外，七氟烷对大鼠认知功能的有害影响具有时间依赖性，具体表现为，使用七氟烷时间越长，对认知功能的损害越明显。

2.七氟烷诱导大鼠海马SP1和α7nAChR表达异常，炎症反应和细胞凋亡。

我们首先测量了POCD大鼠海马组织中SP1和α7nAChR的表达水平。结果显示，与正常大鼠相比，POCD大鼠中SP1的mRNA和蛋白表达均上调（图2A，B），七氟烷刺激的海马中SP1的阳性率也增加（图2B，2C）。但是，七氟烷诱导的POCD大鼠海马组织中α7nAChR的mRNA和蛋白表达显著下降，这提示CAP失活了（图2D，E）。除了海马组织中促炎因子的mRNA表达增加外，我们还发现七氟烷麻醉显著提高了大鼠血清中促炎因子的含量（图2F，G）。此外，七氟烷麻醉可加剧大鼠海马神经元凋亡（图2H）。七氟烷5h给药比2h给药更容易导致大鼠海马发生病理改变。

3.七氟烷对海马神经元SP1和α7nAChR的表达，炎症反应和细胞凋亡均产生不利影响。

为了进一步研究SP1在七氟烷诱导的POCD中的作用，我们通过用不同浓度的七氟烷处理培养的海马神经元来建立POCD细胞模型。qPCR的结果表明，七氟烷治疗剂量依赖性地增加了神经元中SP1 mRNA的表达水平并降低了α7nAChR mRNA的表达水平（图3A，B）。蛋白质印迹分析还显示，在七氟烷处理的神经元中，SP1的蛋白表达上调，而α7nAChR则下调（图3B，E）。免疫荧光分析表明，与对照组相比，七氟烷诱导的神经元中SP1的阳性水平也升高了（图3C）。使用qPCR和Elisa法，发现5％的七氟烷麻醉会使海马神经元IL-1β，TNF-α和IL-6的mRNA表达水平和含量均显着升高（图3F，G），导致更加严重的炎症反应。此外，与对照组相比，5％的七氟烷治疗使神经元的凋亡增加了近3倍（图3H）。

4.敲减SP1可以通过激活CAP减轻七氟烷对海马神经元的不利影响。

有研究表明，MLA是α7nAChR的特异性拮抗剂，MLA可以拮抗阿尔茨海默氏病中的α7nAChR并阻断α7nAChR介导的神经保护作用。服用MLA还可以加剧Aβ1-42介导的神经元细胞的损伤和死亡。因此，为了阐明SP1在七氟烷诱导POCD调节的潜在机制中的作用，在5％七氟烷处理之前，使用siRNA预先转染有或没有MLA的海马神经元以敲减SP1。如图4A和B所示，敲减后七氟烷刺激的神经元细胞中SP1的增加显著降低，siRNA转染可有效减轻5％七氟烷对神经元中α7nAChR表达的抑制作用（图4C，D）。此外，在敲减SP1的海马细胞中，IL-1β，TNF-α和IL-6的mRNA表达水平和蛋白含量与未敲减时相比，其增高明显被抑制，这种抑制作用可以被MLA抵消（图4E，F）。我们还发现MLA对七氟烷诱导的神经元凋亡具有类似作用（图4G）。我们的结果表明，SP1通过激活CAP抑制七氟烷引起的海马神经元神经炎症反应和细胞凋亡。

醉翁之艺点评

近年来，各项研究表明七氟烷是POCD的一个诱发因素。在该项研究中，该团队首先在POCD体内模型证明了七氟烷刺激可以导致大鼠的认知功能明显降低。此外，该团队进一步验证了在POCD体内模型以及POCD体外模型情况下均可诱导神经炎症和细胞凋亡。

各项研究表明SP1是在多种组织中表达并参与多种生物学功能调节的转录因子，并且可以促进AD患者发生神经炎症。该团队的研究表明SP1是七氟烷引起的POCD发病机理的有害因素，而敲减SP1则可明显减轻了海马神经元的炎症反应和细胞凋亡。

综上所述，SP1是七氟烷诱导POCD过程中的一个催化因子，敲减SP1可减轻七氟烷对海马神经元的炎症反应以及细胞凋亡，其机制可能与减轻CAP的失活有关。

（苏殿三审校张一哲编译）

原始文献： Lv, G.; Li, C.; Wang, W.; Li, N.; Wang, K., Silencing SP1 Alleviated Sevoflurane-Induced POCD Development via Cholinergic Anti-inflammatory Pathway. Neurochem Res 2020, 45, (9), 2082-2090.