PLOS Biology:天津医科大学吴旭东建立可诱导的CRISPRi细胞和小鼠模型

2020
12/14

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2020诺贝尔化学奖授予法国和美国科学家Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna,表彰她们在基因组编辑方法研究领域作出的贡献。


2020诺贝尔化学奖授予法国和美国科学家Emmanuelle CharpentierJennifer A. Doudna,表彰她们在基因组编辑方法研究领域作出的贡献。

近些年,CRISPR/Cas9系统除了被广泛应用于基因编辑中,科学家们还拓展、开发了 CRISPRi 系统:对Cas9 进行点突变使其不切割基因组并保留结合gRNA的能力,再融合抑制基因表达的蛋白元件KRAB、SID4X等,达到下调基因表达水平的目的。

目前的CRISPRi系统通常通过病毒感染的方式过表达dCas9-KRAB和gRNA,效率低下,并且可能导致细胞功能异常,因此,迫切需要更便于操作的研究模型。

近日,天津医科大学 吴旭东 课题组在Plos Biology上发表了题为: Generation andvalidation of versatile inducible CRISPRi embryonic stem cell and mouse model  的研究论文, 在胚胎干细胞和小鼠模型中构建了可诱导和可回复的CRISPRi体系。


研究团队构建了可诱导和可回复的CRISPRi体系:在A2Loxcre小鼠胚胎干细胞 (Rosa26-rtTA,Hprt-TRE-Cre) 中,通过同源重组插入dCas9-KRAB融合基因片段,因此可以通过多西环素 (Dox) 的添加实现可诱导的dCas9-KRAB的表达 (iKRAB-ESC) 。在引入特定sgRNA之后,有效地维持相应基因的转录沉默;利用细胞分化和重编程模型,研究者证明通过Dox添加的时机,限制特定位点的激活可以影响细胞命运的动态转变 (图1) ,并构建功能模型进行了sgRNA文库的筛选。这一可诱导模型为干细胞自我更新、分化、重编程等细胞命运决定过程中的关键基因或者顺势调控元件 (各选择性启动子、增强子等) 的功能研究或者筛选提供了便利。

图1.iKRABESC时空特异的CRIPSRi效应
 
值得一提的是,研究者明确提出:dCas9-KRAB对于已激活的启动子和增强子的抑制作用有限,原因是singlegRNA介导的dCas-KRAB并不足以对抗活跃的染色质环境,无法建立异染色质状态。如果几个sgRNA串联组成multi-gRNAs,可以提高转录抑制效率。
 
将iKRAB-ESC进行囊胚注射,研究者构建了iKRAB敲入 (KI) 的小鼠模型,在体内外特定组织或者细胞类型中,在特定时间实现可诱导CRISPRi效应,通过简便的gRNA导入即可应用于基因或者调控元件的功能研究或者筛选,甚至疾病模拟 (图2)

图2. iKRABKI小鼠可能的应用
 
目前,研究者给国内外多家实验室共享了该体系,并启动了一项合作研究。此外,研究者还在改造位于Rosa26区域的rtTA,使其带上Loxp位点。因此,后续升级版的条件性可诱导CRISPRi小鼠 (ConiKRAB) 小鼠,在注射特定Cre或者与Cre小鼠杂交以后,可以实现时空特异的CRISPRi效应。

据悉,天津医科大学吴旭东教授实验室的研究生李睿夏贤友王星(已毕业)为该论文的共同第一作者,吴旭东教授为论文通讯作者。此外,北京大学何爱彬教授实验室帮助设计和合成了CRISPRi筛选相关的sgRNA文库。
 
论文链接:
https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.3000749
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关键词:
天津医科大学,干细胞,小鼠,模型,细胞,诱导,建立,基因

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