循环肿瘤细胞 PD-L1 表达在非小细胞肺癌免疫治疗中的应用

王亚东1，杨笑盈1, 2，贾梓淇1, 2，邴钟兴1，杨华夏3，杨延莲4，胡志远4，李单青1，梁乃新1

1. 中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 胸外科（北京  100730）

2. 北京协和医学院八年制临床医学专业（北京  100005）

3. 中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 风湿免疫科（北京  100730）

4. 国家纳米科学中心（北京  100190）

通信作者：梁乃新，Email：pumchnelson@163.com

关键词： 循环肿瘤细胞；程序性死亡受体配体-1；非小细胞肺癌；免疫治疗；综述

引用本文：王亚东，杨笑盈，贾梓淇，邴钟兴，杨华夏，杨延莲，胡志远，李单青，梁乃新. 循环肿瘤细胞 PD-L1 表达在非小细胞肺癌免疫治疗中的应用. 中国胸心血管外科临床杂志, 2021, 28(1)：110-115. doi: 10.7507/1007-4848.202003026

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摘要

肺癌是全世界发病率及病死率最高的恶性肿瘤。近年来，针对程序性死亡受体 1（programmed cell death 1，PD-1）及其配体（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）的免疫检查点抑制剂治疗显著改善了非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者的预后。然而在非选择人群中免疫治疗的客观应答率仅约 20%，因此选择出免疫治疗潜在的获益人群非常重要。通过免疫组织化学检测肿瘤组织中 PD-L1 的表达可以在一定程度上预测免疫治疗的疗效，但是其仍有一定的局限性。最新临床研究表明循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）上 PD-L1 的表达（PD-L1 expression in circulating tumor cells，CTC-PD-L1）是一种潜在的独立生物标志物，其可为 NSCLC 的免疫治疗提供重要信息。本文将对 CTC-PD-L1 检测技术及其在 NSCLC 患者免疫治疗效果中的预测价值及最新临床研究进展进行综述。

正文

肺癌为目前全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，肺癌的分类中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占 85%，晚期 NSCLC 患者的 5 年生存率不足 5%[1-2]。近年来，免疫检查点抑制剂的出现显著改善了晚期 NSCLC 患者的生存状况，尤其是程序性死亡受体 1（programmed cell death 1，PD-1）及其配体（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）的抑制剂改变了晚期 NSCLC 患者的治疗方案[3]。免疫治疗显示出持久的临床反应，显著提高了局部晚期和转移性 NSCLC 的无进展生存期（progression-free survival，PFS）及总生存期（overall survival，OS）[4-7]。

尽管免疫治疗显著改善了晚期 NSCLC 患者的预后，但是只有约 20% 的 NSCLC 患者会对免疫检查点抑制剂产生反应[8]。考虑到免疫治疗中可能的不良反应以及经济负担，寻找可以准确预测免疫治疗反应的生物标志物具有重大的临床意义，这也是现阶段 NSCLC 免疫治疗中面临的最大难题。通过免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）检测肿瘤组织中 PD-L1 的表达可以在一定程度上预测肿瘤对免疫治疗的反应，但其并非完美的预测标志物。目前有关 PD-L1 IHC 的争议主要体现在以下 4 个方面：（1）临床研究中发现，约 10% PD-L1 表达阴性的 NSCLC 患者仍能从免疫治疗中获益，组织中 PD-L1 表达与免疫治疗的疗效关系并不确定[9]。（2）肿瘤具有空间异质性，肿瘤内部、原发灶与转移灶之间 PD-L1 的表达可能相当异质，因此单个位点的组织活检不能很好地代表患者整体的肿瘤状况[10-11]。（3）在疾病进程中不同时间节点肿瘤组织 PD-L1 表达并非固定不变，而是在动态变化中，具有时间异质性[12]。（4）PD-L1 IHC 目前缺乏规范化的检测标准与检测流程，不同的免疫治疗药物配套不同的 PD-L1 检测方法。而不同检测方法中采用的抗体及对 PD-L1 阳性的定义不同，从而给临床应用带来困难[13]。虽然进行多位点或者连续活检可以部分解决上述问题，但是由于活检的侵入性及可能造成肿瘤转移等潜在风险，通常认为并不可行。因此临床中迫切需要新的检测方法能够准确预测免疫治疗疗效，且能够长期动态监测 PD-L1 的表达变化以更好地揭示肿瘤的生物学特征及监测治疗反应。

相关研究表明分析循环肿瘤细胞（CTC）上 PD-L1 的表达（PD-L1 expression in circulating tumor cells，CTC-PD-L1）可能为选择患者进行免疫检查点抑制剂治疗及长期动态监测提供一种可行的非侵入性手段，并有望揭示 NSCLC 在接受免疫治疗后如何进化和产生耐药性等关键问题。目前肿瘤转移的“种子-土壤”学说被普遍接受，作为转移驱动的前体，CTC保留了原发肿瘤细胞及转移肿瘤细胞的特性[14]。因此 CTC-PD-L1 的表达检测能够更全面地反映原发灶及转移灶的重要生物学特征，并能够提供有关药物敏感性、治疗疗效预测及预后判断的重要补充信息[15]。本文总结了目前 NSCLC 免疫治疗领域中有关 CTC-PD-L1 表达的相关研究，评估 CTC-PD-L1 表达预测免疫治疗疗效的潜在作用及其动态变化在评估治疗反应中的应用，并探究 CTC-PD-L1 检测的局限性及应用前景。

1   CTC 及 CTC-PD-L1概述

1869 年 Ashworth 在对 1 例肿瘤死亡患者尸检时发现其外周血中存在形态及体积与原发肿瘤相似的细胞，首次提出 CTC 这一概念[16]。随着研究的不断深入，其概念被逐步扩展为：自发或因诊疗操作脱离原发灶或者转移灶进入外周血液循环的肿瘤细胞[14]。CTC 检测主要包括两个技术环节，即细胞的分离富集和分析鉴定[17]。CTC 的成功分离鉴定才能进一步检测 CTC-PD-L1 的表达，从而探究其在 NSCLC 免疫治疗临床实践中的价值与意义。

2015 年 Mazel 等[18]首次在转移性乳腺癌患者外周血 CTC 上检测到 PD-L1 的表达，证实了 CTC 细胞膜上具有 PD-L1 蛋白的表达并且验证了 CTC-PD-L1 检测的可行性。随后 Nicolazzo 等[19]在晚期 NSCLC 患者外周血 CTC 上检测到 PD-L1 的表达，并发现 CTC-PD-L1 的动态表达与免疫治疗疗效相关联。目前检测 CTC-PD-L1 表达普遍采用的方法是利用荧光标记的 PD-L1 抗体与 CTC 细胞膜上的 PD-L1 蛋白相结合，通过在荧光显微镜下检测荧光强度来判定 CTC-PD-L1 的表达。尽管不同研究中 CTC 分离鉴定技术及 PD-L1 抗体的类型存在差异，但是均提示检测 CTC-PD-L1 的表达具有极强的可行性[19-24]。

2   CTC 在NSCLC免疫治疗中的应用

多项研究表明，NSCLC 患者在接受放化疗及靶向治疗过程中，CTC 为预后不佳的独立预测因素[25-27]。但是在免疫治疗领域 CTC 能否进行有效的疗效预测和预后评估有待进一步探究。

Guibert 等[20]检测了 96 例化疗后疾病进展准备接受 Nivolumab 治疗的转移性 NSCLC 患者外周血中 CTC 含量，分析结果发现基线时 CTC 含量高的患者预后不佳，而 PFS 超过 6 个月的患者基线 CTC 含量显著降低。对疾病发生进展的 24 例患者再次检测 CTC 时发现其平均值相较于免疫治疗开始前显著增高（52.5/7.5 mL vs. 30/7.5 mL，P=0.03），因此 CTC 含量的增加预示着免疫治疗效果不佳，这在另一项类似研究中也得到证实[28]。Tamminga 等[29]的研究纳入了 104 例接受免疫治疗的 NSCLC 患者，在免疫治疗前及免疫治疗过程中两次抽取外周血，发现未检测出 CTC 的患者其 PFS 及 OS 均显著优于检测出 CTC 的患者。此外，通过对比前后两次 CTC 的检测结果发现 CTC 含量下降的患者更能从免疫治疗中获益，Alama 等[30]也观察到此现象。

综合以上研究结果，目前 CTC 被认为是 NSCLC 免疫治疗效果不佳的独立预测因素，在免疫治疗过程中 CTC 含量的下降预示患者从免疫治疗中获益而 CTC 含量的增加则预示患者的预后不佳。

3   CTC-PD-L1 的表达检测在 NSCLC 免疫治疗中的应用

既往有研究探索了 CTC-PD-L1 检测在手术及放化疗等传统治疗中的价值与作用，这对于更好地理解 CTC-PD-L1 与免疫治疗的相互作用关系具有重要意义。Admas 等[31]的研究结果表明放疗可诱导 CTC-PD-L1 的表达增加，但并未发现 CTC-PD-L1 与预后之间的关联。Wang 等[32]在接受放疗或同步放化疗的患者中同样观察到了 CTC-PD-L1 表达的增加，并且发现基线 CTC-PD-L1 阳性的患者预后不佳。对于接受化疗的患者，有研究分别检测化疗前后 CTC-PD-L1 的表达发现其检出率增加，CTC-PD-L1 被认为是化疗预后不佳的独立预测因素[33-35]。此外，由于肺静脉相较于外周静脉更靠近原发肿瘤，肺静脉中 CTC 数量相对集中，因此从肺静脉中抽血可以提高 CTC-PD-L1 的检出率[36]。Dong 等[37]于术中抽取 114 例早期 NSCLC 患者的肺静脉血检测 CTC-PD-L1 的表达情况，发现 CTC-PD-L1 阳性的患者术后无病生存期（disease-free survival，DFS）更短，术后更早出现复发。

综合以上研究，目前 CTC-PD-L1 被认为与 NSCLC 预后不佳相关，其通过与免疫系统相互作用形成免疫抑制性的肿瘤微环境，使得肿瘤逃避免疫系统的清除，具有更强的侵袭转移能力从而导致患者预后不佳[38]。此外，放化疗等传统治疗可诱导上调 CTC-PD-L1 的表达，放化疗联合免疫治疗可能产生增敏作用，从而使更多患者从免疫治疗中获益。因此进一步探究 CTC-PD-L1 与免疫治疗之间的相互作用关系对于免疫治疗的临床实践具有重要的价值与意义。

目前国内外 NSCLC 免疫治疗领域有关 CTC-PD-L1 的研究多聚焦于晚期患者，共同探究 CTC-PD-L1 的表达能否成为预示患者从免疫治疗中获益的有效生物标志物。此外，相较于传统手术或者穿刺获得肿瘤标本后行免疫组织化学检测 PD-L1 表达，血液检测相对无创，在疾病治疗期间可以反复进行。因此通过抽取外周血检测 CTC-PD-L1 表达可以作为液体活检进行纵向对比分析，这对监测免疫治疗反应及揭示肿瘤细胞如何对治疗策略产生抗性具有重要作用。由于目前关于 CTC 分离富集、分析检测及 CTC-PD-L1 的表达检测流程尚未形成统一共识，因此需要对各个研究结果进行谨慎的分析与比较，国内外相关研究信息汇总见表1。

3.1   CTC-PD-L1 对于 NSCLC 免疫治疗的疗效预测

共计 4 项研究评估了免疫治疗开始前外周血 CTC-PD-L1 表达水平对于免疫治疗疗效的预测作用。其中最大规模的临床研究共纳入 96 例患者，结果显示治疗前 CTC-PD-L1 水平与 PFS 及 OS 的差异均无统计学意义。该研究同时发现免疫治疗开始前 PD-L1 表达阳性的 CTC 占总体 CTC 比值>1% 的患者中对免疫治疗无应答的患者相较于 CTC-PD-L1 表达阴性的患者中无应答者（68% vs. 40%，P=0.04）占比更高[20]。另外 3 项研究[21-23]均表明治疗前 CTC-PD-L1 水平与预后不相关。

由于以上均为小样本临床研究，因此应谨慎对待目前的结论，后续需要开展更大规模的临床研究进行探究。最近，一项旨在评估在寡转移 NSCLC 中 Durvalumab 和 Tremelimumab 双重免疫治疗联合立体定向放疗安全性的ⅠB 期临床研究（NCT03275597）将 CTC-PD-L1 作为预测治疗效果的探索性标志物，目前该研究正在招募患者。随着更多相关研究的开展，CTC-PD-L1 的表达作为预测免疫治疗疗效的标记物的价值将被进一步明确，从而有望协助筛选出免疫治疗潜在的获益人群。

3.2   CTC-PD-L1 的动态变化在评估治疗反应中的作用

由于肿瘤组织的难以获取以及在免疫治疗进程中 PD-L1 的动态变化，基于 IHC 学的肿瘤组织 PD-L1 表达检测无法用于动态评估免疫治疗进程中肿瘤的生物学特征。而基于液体活检的 CTC-PD-L1 检测可以弥补传统检测方法的不足，能够提供更多有关肿瘤耐药及疗效评估的重要信息。

Janning 等[24]纳入 11 例接受免疫治疗的 NSCLC 患者，分别于治疗前、治疗开始 3～5 周期后及疾病发生进展时检测外周血 CTC-PD-L1 的表达状况，结果显示所有对免疫治疗产生应答的患者，其 PD-L1 阳性的 CTC 数目降低或者维持不变，而所有发生疾病进展的患者 PD-L1 阳性的 CTC 数目均上升且所有 CTC 上均能检测到 PD-L1 的表达。因此 PD-L1 阳性的 CTC 数目的动态上升能够成为预测 NSCLC 患者对于免疫治疗产生抵抗的有效标志物。Nicolazzo 等[19]观察到了类似的结果，其发现免疫治疗 6 个月后所有外周血中能检测到 CTC-PD-L1 表达的患者均发生了疾病进展，而未检测到 CTC-PD-L1 表达的患者均对免疫治疗产生应答。以上研究结果共同提示在免疫治疗过程中，CTC-PD-L1 表达的动态变化能够成为评估治疗反应的有效标记物。

在 Checkmate017 试验中，Nivolumab 组与 Docetaxel 组的生存曲线约在 6 个月时才开始出现分离，这在一定程度上能够反映出免疫治疗与传统放化疗作用机制的不同[9]。传统放化疗直接杀伤肿瘤细胞，而免疫治疗需要进行一段时间后完成免疫系统的再度激活以清除肿瘤细胞。因此对免疫治疗产生应答的患者 CTC-PD-L1 表达将会发生动态下降甚至消失，而 CTC-PD-L1 的表达持续上升预示着免疫治疗的疗效不佳。相关研究表明免疫治疗过程中部分 CTC 上存在 PD-L1 及上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）标志物的共表达，从而使得肿瘤细胞逃避免疫系统的清除，导致患者对于免疫治疗的反应不佳[39-40]。

目前在 NSCLC 免疫治疗过程中仍主要通过传统的影像学检查来评估及监测治疗疗效。由于目前影像学检查无法将免疫细胞与肿瘤细胞区分开，因此无法判断影像学上病灶的扩大是由于免疫治疗起效后大量的免疫细胞浸润所造成的“假进展”还是由于患者对于免疫治疗无应答开始出现疾病进展，因此对于病情判断存在滞后效应，不利于临床决策的及时进行[41]。通过动态监测 CTC-PD-L1 的表达能够帮助评估免疫治疗反应。如果患者的影像学检查提示病灶扩大，而其余各项检查指标未见明显异常，那么患者影像学的表现可能是免疫治疗造成的“假进展”。而如果患者 CTC-PD-L1 表达显著增加，虽然影像学检查尚未提示疾病进展，临床医生此时需要谨慎评估患者治疗反应状况，及时判断是否需要尽快更换治疗方案。随着免疫治疗在 NSCLC 领域的广泛开展，CTC-PD-L1 的表达检测在评估免疫治疗疗效中必将发挥越来越重要的作用。

4   CTC-PD-L1 目前研究的局限性

尽管 CTC-PD-L1 的临床研究取得了可喜的进展，但是目前仍处于研究的初级阶段，有许多问题尚待解决，主要包括目前技术的局限性和临床应用的局限性。只有通过不断完善现有理论与技术，开展更多临床研究，才能将 CTC-PD-L1 表达检测与 NSCLC 免疫治疗紧密结合起来，在疗效评估、个体化治疗、预后监测等方面发挥重要作用。

4.1   CTC-PD-L1 检测技术的局限性

虽然新近开发出许多基于不同原理的 CTC 分离检测技术，但是 CTC 检出率仍偏低，检出数目少，从而限制了其临床应用价值。最近一项研究[42]将 EGFR/HER3 作为新的 CTC 检测标志物与传统 CellSearch 技术相结合，进一步提高了 CTC 的检出效率。此外，即使目前 PD-L1 IHC 采用的 PD-L1 抗体均为 4 种药品与食品监督管理局（FDA）已批准的抗体，其不同抗体的检测结果之间仍存在显著差异。有研究[43-44]评估比较了不同检测试剂盒、检测平台测定肺癌组织样本 PD-L1 表达的准确性和可靠性差异，结果显示：28-8、22C3 和 SP263 试剂盒的检测结果一致性较好，而 SP142 检测的 PD-L1 水平偏低。目前检测 CTC-PD-L1 表达的抗体选择尚无统一标准，因此我们应谨慎比较应用不同 PD-L1 抗体得到的检测结果，尽快完成 CTC-PD-L1 检测技术及流程的标准化。有研究[45]采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase Chain reaction，RT-PCR）技术检测 CTC 中 PD-L1 mRNA 的表达，并由此计算出 PD-L1 的阳性率，在一定程度上可减少不同抗体导致检测结果的差异。

4.2   CTC-PD-L1 临床应用的局限性

随着免疫治疗在 NSCLC 领域的广泛开展，越来越多的患者有机会从免疫治疗中获益。值得注意的是，许多患者是在接受化疗、放疗、靶向等治疗疾病发生进展后开始采用免疫治疗，因此在评估 CTC-PD-L1 表达时需要充分考虑既往治疗对于检测结果的影响[31-32]。此外 CTC-PD-L1 检测目前经济成本较高，从获取样本到分析结果耗时较长，也在一定程度上阻碍了其临床应用。目前 CTC-PD-L1 检测及其应用尚未经过大规模多中心的临床试验验证，因此 CTC-PD-L1 检测尚不能完全代替肿瘤组织中 PD-L1 的表达检测。

5   总结与展望

CTC-PD-L1 表达检测在预测 NSCLC 免疫治疗疗效尤其是在免疫治疗过程中动态监测疾病变化及评估治疗反应具有广阔的应用前景。CTC-PD-L1 检测技术的发展能够帮助我们更全面地理解 NSCLC 的免疫治疗。目前 CTC-PD-L1 的相关研究仍处于初级阶段，诸多问题还需要更深入的研究及大规模的临床试验来回答。但是作为一种简便可行的液体活检技术，其在即将到来的 NSCLC 免疫治疗时代将发挥更加重要的作用。

利益冲突：无。

作者贡献：王亚东、杨笑盈、贾梓淇和邴钟兴负责或参与本文的论文设计与初稿撰写；杨华夏、杨延莲、胡志远、李单青和梁乃新对文章的相关内容进行审阅和修改。

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