完美！纳米孔测序应用于动物疫病诊断

来源：原博士带你做检测 

Nanopore sequencing，纳米孔测序，顾名思义就是通过固定在膜上的纳米孔对单链DNA或者RNA，甚至蛋白质进行测序的方法，这一大胆的想法早在二十世纪八十年代即有科学家提出（图1）。

图1 美国加利福尼亚大学David Deamer教授在笔记本上绘制的纳米孔测序概念图

（绘制日期为1989年6月25日）

纳米孔测序的核心是一个可以通过单条DNA的纳米级别的小孔，将其固定在膜上，并浸入含有离子的水溶液中。当在膜的两侧加上不同的电位，离子就会通过蛋白质小孔，从膜的一侧移动到膜的另一侧，小孔当中就会形成电流。而当DNA的单链通过这个小孔时，就会对离子的流动造成阻碍，不同的碱基序列产生不同的电流波动，这种波动通过生物传感器，被计算机记录下来。每当1条DNA链通过纳米孔就会生成1条reads，最终通过生物信息学分析方法将其转化成为DNA序列。

图2：纳米孔芯片的组成（摘自https://nanoporetech.com/how-it-works）

图3：纳米孔测序原理（摘自[1]）

在1996年首次证明单链DNA可以通过α-溶血素形成的纳米孔，以及在1999年确证纳米孔可以区分单个嘧啶和嘌呤RNA分子之后，Hagan Bayley和Spike Willcocks, David Norwood and Gordon Sanghera等人在2005年一起成立了Oxford Nanopore Technologies公司，也就是大家熟知的ONT公司。该公司在2008年获得DNA测序专利，并于2014年6月发布他们的首款产品MinION，一经面世，世界哗然。

图4 纳米孔测序的里程碑（摘自[1]）

ONT是目前最成功的纳米孔测序公司，因此通常说到纳米孔测序大家首先想到的就是ONT，但是纳米孔测序其实代表了一类基于纳米孔进行测序的技术，存在着各种不同的技术路线，比如生物纳米孔测序和固态纳米孔测序等。今年齐碳科技发布了我国首个生物纳米孔测序仪，儒翰基因科技有限公司则发布了我国首个固态纳米孔测序原型样机。测序将是未来基因研究和疫病临床诊断的基本工具，也是又一个科技制高点，希望我国能在纳米孔测序领域占据一席之地。

齐碳科技的纳米孔测序仪

  儒翰基因 固态纳米孔基因测序仪原型机

有的人把纳米孔测序归为第三代测序技术，也有的人归为第第四代测序技术，叫第几代并不重要，重要的是到底能不能用于动物疫病的检测和诊断呢？答案是能。理论上分析有如下几点原因：

第一：仪器体积够小

MinION测序仪重约100g，体积为10× 3 × 2 cm，大小与一个标准订书机大小相当，通过USB3连接电脑即可开始测序，这与传统动辄一人高的测序仪形成鲜明对比。现在有带着它各种极端环境开展测序的照片，比如在冰川，火山，太空，极地测序等等，这样便携式的机器为动物疫病现地测序检测提供了可能。

图5 PacBio测序仪和ONT测序仪MinION

图6 在太空和野外采用MinION测序仪测序

第二：芯片数据量够大

MinION测序仪配套的芯片（即flow cell），目前一张价格¥8900，其中包含2048个独立的纳米孔，每4个一组与1个生物传感器相连，即共有512个传感器，官方报道一次试验该芯片可以产生30Gb的数据量。这对于一般引起动物疫病的常见病原，如基因组在Kb量级的病毒，以及基因组在Mb量级的细菌来说，显得富富有余。比如，目前已知的最大可引起动物疫病的非洲猪瘟病毒，基因组在170~190Kb，若采用MinION芯片来测，一次即可测得15万倍的测序深度。

图7 MinION芯片测ASFV的理论测序深度

第三、建库操作够快

纳米孔提供的建库试剂盒包括连接建库和快速建库两个大类，一种是为了获得尽可能多的数据，官方报道建库耗时60min；一种是为了尽可能快的完成建库操作，官方报道建库耗时10min。虽然这里的时间并不包括核酸提取以及如果目标序列是RNA的话还需要增加第一二链合成步骤，但与之前一、二代测序相比，还是具备时间优势的，也为测序技术应用到突发疫病的快速诊断提供了可能。

图8 ONT建库试剂盒

第四、测序速度够快

目前ONT官方报道的测序速度是DNA 450bp/s，RNA 70bp/s。也就是说，如果一次测序按照512个传感器有50%工作，只需2.5小时即可获得1Gb数据。

第五、下机数据质量够用

ONT官方报道目前正在使用的R9.4芯片准确率在92%左右，比起一代和二代测序 “千足金”的准确率的确显得有点落后，但这也是其测序原理与一二代不同所致。与一二代测序收集光信号不同，纳米孔测序收集的是电信号，而ATCG四种碱基分子又非常相似，不同组合产生的电流信号差别就会非常细微。另外纳米孔在测序过程中收集电信号也并非一次收集一个碱基，而是收集4~6个碱基的电信号，这样就会产生近六千种组合的电流信号。因此，后续通过软件分析电流信号生成序列信息就会产生一定的误差，尤其是遇到连续数个相同的碱基时，错误率往往更高。另一方面，纳米孔测序可以不经过PCR直接对样品中的核酸进行测序，每一条序列只测一次，就无法像二代测序那样进行相同片段的矫正，这也是造成它错误率高的另一个原因。但是，对于动物疫病诊断来说，92%这个准确率虽然不能用来判断是不是某个碱基出现了变异，但足以确定它是不是这个病毒或者细菌。

参考文献：

1. Deamer, D., M. Akeson and D. Branton, Three decades of nanopore sequencing. Nat Biotechnol, 2016. 34(5): p. 518-24