文献精读 | 关于膜介导的全麻机制的研究

为明确麻醉药对细胞膜上GM1脂质筏的作用，作者用1mM浓度的三氯甲烷处理神经母细胞瘤2A（N2A）细胞系。因为GM1脂质筏低于光的衍射极限，需要使用直接随机光学重建显微镜（direct stochastical optical reconstruction microscopy, dSTORM）超分辨率成像方法。因此作者同时通过dSTORM监测CTxB的荧光丛集情况（图1A），

图1B、C展示了三氯甲烷可以显著增加细胞膜上GM1脂质筏的表观直径（在给定的聚类半径下观察到的直径）和面积。异氟烷（1mM）的效果与三氯甲烷类似（图1A-C）。在给予氯仿或异氟醚后，雷普利半径 (Ripley’s radius, 结构域之间的表观空间的量度) 急剧减小（图2B），并且每个细胞上的脂质筏数量和总面积均升高（图1D-F，图2C）。

甲基倍他环糊精（Methyl-β-cyclodextrin, MβCD）可将细胞膜上的胆固醇移除并干扰GM1脂质筏的功能，降低GM1脂质筏的总数（图1D）。将GM1脂质筏分为小(0 - 150 nm)和大(150 - 500 nm)两组，在不同麻醉药的作用下脂质筏的表观直径明显不同，而经MβCD处理后的结果则相反（图2D）。在C2C12成肌细胞（肌细胞）中所获结果类似，三氯甲烷可显著升高GM1脂质筏的表观直径（图2E-H）。

图1

图2

既往研究表明麻醉药激活TREK-1需要通道蛋白C端无序环的参与（图1A，B），而PLD2也可通过该结构结合并激活TREK-1。因此作者假设，如果麻醉药是通过PLD2来发挥作用的，那么阻断PLD2的催化活性应该能阻断麻醉药对TREK-1通道的作用。

作者在HEK293细胞系中过表达TREK-1伴随失去催化活性的K758R PLD2突变蛋白（xPLD2，可致PA生成受抑）。作者发现xPLD2（较内源性PLD2的表达量高10倍，图1D）阻断了所有可测得的三氯甲烷相关电流（图2A-C）。没有转染TREK-1的细胞中检测不到相关电流，也不受三氯甲烷影响，这提示麻醉药主要经PLD2依赖的途径激活体外培养细胞中的TREK-1通道（图2D）。在缺乏PLD2的情况下，尽管生物膜中有非常高浓度的麻醉药，该通道还是无法开放。

图1

图2

TWIK相关花生四烯酸激活的K通道（TRAAK）是麻醉药物不敏感的TREK-1的同源受体（图1E）。正常TRAAK对PLD2并不敏感，而将PLD2与TRAAK的N末端连接起来后，可最大程度地激活TRAAK；而若将TREK-1的PLD2结合域引入TRAAK，将使TRAAK对PLD2更加敏感。如果PLD2是介导TREK-1对麻醉药敏感的重要媒介，那么通过在TRAAK的C末端引入PLD2结合域应能改变TRAAK对麻醉药物的敏感性（图2A）。

作者在HEK细胞系中过表达了对PLD2敏感的TRAAK嵌合体（TRAAK/ctTREK）。与设想相同，给予1mM 三氯甲烷处理后，TRAAK/ctTREK对三氯甲烷反应明显（图2B-D）。为了明确该反应性是由于PLD2的参与而不是由于麻醉药直接改变了TREK-1的C末端结构，作者在嵌合体中过表达xPLD2后，发现三氯甲烷对该通道失去了作用。

由于TRAAK和TRAAK/ctTREK的跨膜结合域结构一致，因此跨膜结合域应当不是TREK-1对麻醉药敏感的作用位点，而是PLD2及其产物PA（图2E）。并且，由于在麻醉药存在时仍然缺乏TREK-1相关电流，因此麻醉药与该通道的直接结合不足以激活该通道。

为进一步明确麻醉药是否可以直接激活TREK-1，作者将纯化的TREK-1重新构建成脂质囊泡，并在无细胞系统中测试有或无麻醉药条件下的离子通量。钾的流出与囊泡中质子酸化及PH的荧光读数偶连。在16:1的PC脂质体与18:1的磷脂酰甘油（PG）（85:15 mol百分比）中重建的TREK-1不受三氯甲烷或异氟烷的影响（图1F、G）。为了确认重建通道的有效性及其在合适条件下允许钾离子内流的能力，作者重组了一个带有双半胱氨酸的TREK-1突变体，可通过共价键锁定TREK-1的激活状态。在之前的研究中，该方法被证明可以直接抑制局麻药的作用，这进一步证明了作者已成功地、功能性地重建了TREK-1通道。结果表明，与锁定激活态的TREK-1对照相比，麻醉药无法直接激活TREK-1（图1F、G）。

图1

图2

作者推断，如果吸入麻醉药可以激活PLD2，那么应当可以观察到PLD2离开GM1脂质筏。为了直接观察PLD2的迁移，作者使用dSTORM对PLD2和GM1脂质筏的共定位进行成像。通过计算麻醉前后PLD2和CTxB标记脂质的成对相关性（pair correlation）来确定PLD2发生迁移。在确定脂质筏的表观尺寸时，成对相关避免了来自过采样和用户选择参数的潜在伪影（图1）。N2A和C2C12均可内源性地表达TREK-1和PLD2，因此可以观察到它们在内源性启动子驱动下发生的迁移。TREK-1不会发生棕榈酰化，但该蛋白与棕榈酰化的PLD2形成络合物，并阻碍了PLD2/TREK-1复合物进入GM1结合域，进而促进了PLD2降解PC生成PA。

给予N2A细胞三氯甲烷或异氟烷处理后，PLD2自GM1脂质筏上离开（图2A）。成对关联分析揭示麻醉前PLD2与GM1脂质筏强相关，但在麻醉后仅呈弱相关（图2B）。这种麻醉诱导的PLD2定位改变在不同大小的GM1脂质筏上都是高度显著（图2B、C），提示麻醉药不仅改变了脂质筏的表观尺寸，更改变了PLD2与GM1结合的动力学。而麻醉药相关的PLD2迁移程度与经MβCD刺激的PLD2迁移程度相似，提示移除胆固醇或给予麻醉药处理对PLD2向脂质筏的迁移有相似的影响（图2D）。在C2C12细胞系中也观察到了类似的现象（图3B、C）

CTxB是一种五聚体毒素，可在活细胞和固定细胞中引起纳米级聚集。由于CTxB诱导的GM1脂质筏聚集会隔离而不是释放PLD2，因此CTxB诱导的聚集并不能解释PLD2的迁移。然而，作者使用荧光漂白后恢复技术（fluorescence recovery after photobleaching，FRAP）检测了固定后膜上的脂质流动性（在GM1和PIP2脂质筏之间的流动性）。FRAP显示固定后的C2C12细胞中CTxB结合的脂质流动性极小（图3E）。此外，与预期相同，在N2A和C2C12细胞中，固定后的PLD2的表观尺寸与GM1脂质筏基本相同。

图1

图2

图3

如果细胞膜上脂质筏功能是TREK-1介导麻醉的普遍机制，那么大多数已知的TREK-1激活剂也应该可以激活PLD2。因此，作者使用一系列不同的麻醉药处理活细胞，通过分析PLD（同工酶1和2）的胆碱释放与荧光信号的偶联来代表PLD的酶促激活性（图1A）。乙醚、三氯甲烷、异氟烷和氙气均能显著激活N2A及C2C12细胞中的PLD2（图1B和2A-C），其中异氟烷对N2A细胞的效果最为明显，而三氯甲烷对C2C12细胞的效果最为明显。三氯甲烷和异氟烷的作用强度存在剂量依赖性，在N2A细胞中最大半数有效浓度EC50分别为1.0±0.56 mM和0.8 mM，Hill斜率分别为2.4±2.8和1.3±0.89（图1C、D）。

而其他麻醉药，例如静脉用的NMDA受体激动剂氯胺酮，以及违反Meyer-Overton法则的F6，对PLD活性均无影响。但丙泊酚（50μM）可显著激活N2A细胞中的PLD2（图1A、B），并可显著升高TREK-1相关电流（图1E、G）。而在共转染xPLD2和TREK-1后，丙泊酚诱导的TREK-1电流被完全阻断（图1F）。这一结果表明，尽管对C2C12的效力较低，丙泊酚通过与吸入麻醉剂相同的途径激活TREK-1。

图1

图2

如果麻醉药在体内能破坏细胞膜功能，激活PLD，那么阻断PLD可以阻断或减轻麻醉。为了监测体内的镇静情况，作者记录了果蝇（果蝇只有一个PLD基因，方便研究）在一个垂直安装的小室中的单动物测量值(活力和位置)(图1A)。缺乏功能性PLD (PLDnull) 的果蝇和野生型 (WT，有PLD) 果蝇被置于三氯甲烷蒸汽中监测镇静作用。镇静状态被定义为在蝇室底部连续5分钟无活动。在2.8 mmol/L三氯甲烷中（三氯甲烷浓度是蒸气浓度，不是体内浓度），镇静PLDnull果蝇所需的暴露时间约是WT果蝇的两倍 (600 s vs 350 s, P＜0.0001)，表明PLDnull对麻醉有显著的抗性(图1B)。在第一只PLDnull果蝇昏迷前，几乎所有果蝇都已被麻醉，而最终所有果蝇都失去了意识。这表明PLD与调控镇静阈值有关，但它并不是调控对麻醉的敏感性的唯一途径。

为了确认脑内GM1结构域的存在，作者解剖了成年果蝇的全脑并用CTxB和一种抗泛神经元标记Elav的抗体进行标记。CTxB标记的脂质的共聚焦成像(图1C，GM1，绿色)显示了GM1脂质在果蝇全脑的稳定表达。在细胞体膜上观察到高密度的GM1脂质筏(图1C)，证实了果蝇中枢神经系统中的脂质结构与细胞培养结果相似。

接着作者想了解在麻醉动物的全脑中是否也存在脂质筏被麻醉药破坏的现象。作者用三氯甲烷麻醉果蝇成虫后解剖它们的大脑，利用dSTORM超分辨率成像对其大脑中的GM1脂质筏进行了观察，并与无麻醉对照进行了比较(图1D)。与细胞培养结果相一致的是，在三氯甲烷处理的果蝇大脑中GM1脂质筏的表观尺寸增大(图1E)，但集落的数量则减少了10%。

最后，作者证实了麻醉药可以激活黑线虫神经元细胞中的PLD。几种麻醉药 (乙醚、三氯甲烷、异氟醚和丙泊酚)均能有效激活果蝇神经元(ML-DmBG2-c2)(图1F-J)。与N2A和C2C12细胞相比，丙泊酚在果蝇神经元中对PLD的激活程度最明显，这证明了第三种细胞对麻醉的敏感性。FIPI(5-氟-2-吲哚酰去氯卤代胺)抑制实验(图1J)则表明其抑制机制在果蝇中保守。

图1