文献精读 | 中枢神经系统小动脉内皮细胞的质膜微囊介导了血管神经偶联

电镜下可区分毛细血管内皮细胞（cECs）和aECs（如图）。微囊蛋白1（Caveolin 1）是质膜微囊的重要组分，caveolin-1敲除小鼠（Cav1-/-）的aECs中囊泡和质膜微囊均缺失，提示囊泡可能是质膜微囊的组分（c, e）。既往研究表明，为了维持血脑屏障的完整性， ECs上质膜微囊的表达通常被抑制，但在不同区段的ECs中被抑制的程度不同。cECs中几乎不表达囊泡（a, d），而在aECs上高丰度表达（b, d）。除了aECs，SMC包裹aECs的一侧胞质内质膜微囊含量丰富（c, f）。

作者使用双光子显微镜同步观察清醒小鼠神经和血管活动（单个血管直径和毛细血管血流）。刷胡须的刺激会引起时空依赖的神经活动，并可通过检测体觉皮层内表达钙离子感受器GCaMP6s的神经元细胞中(Thy1-GCaMP6s)钙内流的情况进行成像（b, c）。对Thy1-GCaMP6s小鼠分别静脉注射Hydrazide和quantum dots，分别对小动脉和毛细血管血流进行成像。在刷胡须刺激后，作者观察到GCaMP信号在体觉皮层神经元内显著增强，随后小动脉舒张，红细胞流速增加（b-g），而在后压部皮层（与胡须刺激无关）中仅观察到极低水平的血管舒张（h, i）。这一结果提示动脉血管直径的改变是胡须刺激相关的神经活动引起的，而不是其它生理活动的影响。

Cav1-/-小鼠的脑内小动脉在胡须刺激后舒张减弱，而WT小鼠和杂合小鼠小动脉仍然明显舒张（1a, c, e; 2a, i）。并且，这种血管舒张障碍的现象在软脑膜动脉和穿支动脉中均存在（3）。值得注意的是，三种基因型小鼠的基线血管直径和舒张能力是一致的（2b-d）。这些结果提示，缺乏质膜微囊不会改变血管基线张力和动力学，但会改变体感诱发小动脉舒张的幅度。

与小动脉直径的改变一致，Cav1-/-小鼠的胡须刺激后毛细血管血流较对照组降低（1b, d, f）而不同基因型的基线毛细血管流速和动力学是相似的（2e, f）。并且，由于三种基因型小鼠的GCaMP6s表达动力学相似（2g, h），且收缩压、舒张压和平均动脉压水平均相似（2j），因此Cav1-/-小鼠中降低的小动脉舒张幅度和毛细血管内血液流速不是由于体感诱发神经活动障碍或血压改变。以上结果表明质膜微囊对神经血管偶联是至关重要的。

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作者接着探索了Cav1-/-小鼠神经血管偶联降低是否是由于SMC的连续性和功能受损。作者给Cav1+/+;NG2-DsRed+（control）和Cav1−/−;NG2-DsRed+两种基因型的小鼠静脉注射hydrazide，NG2-DsRed是SMCs、少突胶质细胞和周细胞的报告子。通过计数hydrazide+小动脉中DsRed+细胞的数量，作者发现SMCs的结构完整（a, b），且多种收缩相关蛋白（α-SMA、MYH11、transgelin、desmin等）的表达情况也相似（c-g）。

在给予血管收缩或舒张药物后，作者使用双光子显微镜观察急性大脑切片中小动脉直径改变情况。作者发现给予U46619（一种TXA2受体激动剂）后，Cav1-/-小鼠中SMCs的收缩能力正常，而随后对同一血管给予diethylamine (DEA)-NONOate（NO供应剂）之后，舒张能力也正常（h-j）。

最后，作者探索了Cav1-/-小鼠中削弱的神经血管偶联是否是由于血管舒张信号释放障碍。作者使用双光子显微镜观察到，在快速注射DEA NONOate之后，WT和Cav1-/-小鼠的SMC和血管的扩张程度均相似（k, l）。这些结果表明，SMC舒张功能正常，但质膜微囊的缺失会影响神经血管偶联。

作者将BMX:creER+小鼠（他莫昔芬可诱导Cre酶在aECs内特异性表达）和Cav1fl/fl鼠进行杂交，在繁育出的条件性敲除鼠中，Cav1仅在aECs内被特异性敲除（1a, c）。电镜结果表明，在条件性敲除鼠中，体觉皮层内aECs的质膜微囊消失，而SMCs以及对照组小鼠aECs中的质膜微囊仍然存在（1b, d）。使用活体成像技术发现，与Cav1-/-全身性敲除鼠的结果一致，给予胡须刺激后，小动脉舒张幅度和毛细血管血流量在条件性敲除鼠中降低（2g-j, 3a），基线小动脉直径和毛细血管血流也未被影响(1e, f, 3b-d)。因此，aECs中的质膜微囊是介导神经血管偶联的重要环节。

图1

作者将Myh11:creER+小鼠（他莫昔芬可诱导Cre酶在SMC细胞中特异表达）与Cav1fl/fl鼠进行杂交，在繁育出的条件性敲除鼠中，Cav1仅在SMC内被特异性敲除（1a-d）。然而，胡须刺激后小动脉舒张和毛细血管血流并未受到影响（2e-h，1e-j）。提示SMC中的质膜微囊并不参与神经血管偶联过程。

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aECs中质膜微囊是如何介导神经血管偶联的呢？质膜微囊参与多种细胞生物学进程，包括在胞吞转运过程中作为机械拉伸时的质膜储备，富集大量受体和离子通道，并参与了胞内信号转导。由于NO是神经血管偶联中介导血管舒张的重要分子，并且之前已有人报道CAV1可与eNOS（由Nos3编码）相互作用，因此本文重点关注NO信号通路在质膜微囊功能中的作用。作者发现，Cav1-/-小鼠中eNOS蛋白和NO的水平与WT鼠基本一致，而eNOS蛋白和NO在Nos3-/-小鼠中表达缺失（1a-d）。为了明确Cav1和Nos3之间的相互作用，作者使用了Cav1和Nos3双敲除鼠。如果Cav1和Nos3位于同一信号通路的上下游，那么双敲除鼠应与单敲除鼠的表型基本一致；而如果表型不一致，说明他们很可能是位于不同的信号通路。使用在体成像发现Nos3-/-小鼠表现出胡须刺激后小动脉舒张和毛细血管血流降低（2a-d），而双敲除鼠则完全丧失了胡须刺激后动脉舒张和红细胞流速增加的反应，但基线数据在这几种敲除鼠中依然一致（2a-d，1e，f）。以上结果表明aECs中的质膜微囊功能不依赖于eNOS，而质膜微囊对神经血管偶联的作用可能与NO一样重要。

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cECs和aECs中质膜微囊的数量存在差异。既往报道CNS的cECs上表达的MFSD2A可抑制质膜微囊的形成，有利于维持血脑屏障的完整性。作者用免疫组化发现MFSD2A在大脑和视网膜aECs上均无表达（1a, d, 2a-d）。既往研究报道相较cECs，Mfsd2a在aECs中转录水平较低。因此CNS的cECs大量表达Mfsd2a来抑制质膜微囊的形成，而aECs由于缺乏MFSD2A而有丰富的质膜微囊。因此作者探究了在aECs中过表达Mfsd2a是否能充分抑制质膜微囊的形成。作者将R26:LSL-Mfsd2a转基因小鼠（Cre酶依赖性表达Mfsd2a）与BMX:creER+小鼠杂交，使用他莫昔芬诱导后，MFSD2A在子代小鼠的aECs中表达量显著上调（1b, e）。同时，电镜结果显示，aECs中质膜微囊的密度显著降低（1c, f）。在体成像观察到胡须刺激后小动脉舒张受限（1g-i，3e）。以上结果表明，在aECs中过表达MFSD2A可以降低质膜微囊密度并阻碍神经血管偶联。并且，抑制质膜微囊在aECs的表达的两种途径（过表达MFSD2A或敲除Cav1）均会使神经血管偶联受损。提示质膜微囊在神经血管偶联中的重要作用。

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