文献精读 | 局部交感神经切除术促抗炎反应并缓解紫杉醇诱发的小鼠机械和冷刺激性痛觉过敏

    抗肿瘤药物（包括一线化学疗法）引起的神经病理性疼痛发生率高达80％，并且目前尚无FDA批准的药物来治疗此类疼痛，许多用于治疗其他种类神经病理性疼痛的药物对化疗诱发的疼痛效果不佳或无效。紫杉醇是多种实体癌的常用化疗药物，引发的神经病理性疼痛在化疗结束后仍持续数月或数年。

    临床证据表明，背根神经节中的免疫细胞在化疗诱导的疼痛样行为（即机械性和冷痛觉过敏））的发生和发展中起关键作用。据报道，各种化疗药可诱导单核细胞浸润到背根神经节和坐骨神经中，并在分化为炎性巨噬细胞，导致类似疼痛的行为。抑制紫杉醇相关的巨噬细胞增加，减少背根神经节中促炎性肿瘤坏死因子α的表达，可以减轻了紫杉醇引起的机械性超敏反应。米诺环素通过抑制单核细胞/巨噬细胞浸润和促炎性细胞因子的表达等作用可预防紫杉醇诱发的机械性异常性疼痛。然而最近的临床研究不支持米诺环素对紫杉醇所致神经病变的预防作用。

    局部交感神经阻滞是一种公认的治疗各种炎性疼痛的临床方法。虽然各种疼痛刺激似乎因交感神经活动而加剧或持续，但局部交感神经切除术是如何影响化疗所致神经病理性疼痛的发生和发展仍有待研究。

    本研究假设交感神经系统活性调节了接受紫杉醇小鼠的背根神经节的免疫反应和疼痛样行为。

动物及操作流程：

    雄性和雌性CD1小鼠（8至10周龄），建立紫杉醇治疗小鼠模型（具体见原文），进行行为学观察和生化实验。

化学交感神经切除术：

    建模前3天，向小鼠腹膜内注射6-OHDA（80mg/kg）。

局部微交感神经切除术：

    在微交感神经切除术中切断L3和L4的灰质分支。对照组也做相应脊髓神经暴露处理，但不切断神经。微交感神经切除术后两天，用紫杉醇治疗小鼠，以模拟化疗诱发的神经病理性疼痛。

巨噬细胞/单核细胞耗竭：

    脂质体包裹的氯膦酸盐用于消耗吞噬巨噬细胞。微交感神经切除术的小鼠在首次注射紫杉醇后第5天和第7天腹膜内注射氯膦酸盐脂质体（15ml/kg），第5、6、7天将INCB3344静脉注射入尾静脉（每次注射100μl 0.18 mM溶液），以部分耗尽单核细胞。

机械性和冷性痛觉过敏：

    使用von Frey纤维刺激后爪来评价机械痛。使用干冰颗粒评价冷性痛觉过敏。在第一次注射紫杉醇之前和注射后1至14天后评估戒断潜伏期。

QRT-PCR：

    紫杉醇治疗7天后，取背根神经节(L3和L4)，脾脏组织。RT-PCR测量细胞因子和单核/巨噬细胞、肾上腺素能和嘌呤能受体以及甘油 3-磷酸脱氢酶。 

免疫组织化学分析：

    4％的多聚甲醛固定背根神经节（L3和L4），30％蔗糖脱水。将背根神经节组织制成12μm切片用于离子钙结合衔接分子1（ionized calcium-binding adaptor molecule1，iba1）的免疫组织化学定量。将背根神经节制成40μm的切片，检测酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,Th）用于检测交感神经纤维。

细胞因子芯片：

    紫杉醇处理7天后，取腰背根神经节（L3和L4），并在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂混合物的裂解缓冲液进行裂解后进行检测。 

电生理学：

    急性分离的全背根神经节进行细胞内电生理记录。 

统计分析：

    GraphPad Prism软件进行统计分析，所有数据以平均值±标准差表示，没有排除异常值。行为数据采用双向重复测量方差分析，然后采用Bonferroni后自组织检验。生化和电生理学数据采用双尾、未配对t检验或单向方差分析，然后采用Tukey后 自组织检验或Mann-Whitney检验，根据D‘Agostino&Pearson总括正态检验，对非正态分布的电生理数据进行分析，统计学意义的标准为P<0.05。

1、全身化学交感神经切除术延缓了紫杉醇诱导产生机械性疼痛的进展和恢复

    在紫杉醇治疗小鼠前3天注射6-羟基多巴胺建立全身交感神经切除模型，如（图1所示），全身失交感神经对小鼠机械刺激阈值对基线无影响。溶剂对照组出现了紫杉醇相关的长达2周的机械性神经病理性疼痛，但全身交感神经切除术组的疼痛无论出现和恢复均出现了延迟。由于酪氨酸羟化酶持续受损长达21天，因此不能归因于交感神经系统恢复。这一结果可能是全身及局部的差异造成。

图1

2、局部微交感神经切除术可减轻紫杉醇诱导的机械性和冷超敏

    化疗所引起的神经病理性疼痛往往发生在远心端，因此，在紫杉醇治疗前2天进行 (图2）一侧交感神经椎旁神经节的灰质支切断并导致由这些神经支配的外周交感神经纤维的功能丧失14天。在紫杉醇治疗前，局部微交感神经切除不影响机械性和冷痛的基线。紫杉醇治疗后，局部微交感切除术在雄性和雌性小鼠的同侧后爪中产生了快速和持续的机械性痛觉恢复（平均值±标准差：手术组vs假手术组，第5天，雄性鼠：1.07±0.34g VS 0.51±0.17g，n=5，P=0.030,雌性鼠：1.08 ± 0.28 g vs. 0.62 ± 0.16 g, n = 5, P = 0.036），而在这些小鼠对侧爪子没有观察到相应变化。

图2

3、局部微交感切除术需要通过单核细胞/巨噬细胞来缓解紫杉醇诱发的机械性痛觉

    巨噬细胞的浸润和激活参与化疗引起的神经病理性疼痛的动物模型中的疼痛样行为。巨噬细胞激活标记物 CD68和其他巨噬细胞标记物EMR1和ITGAM的转录，以及单核细胞趋化蛋白CCL2 及其受体C-C趋化因子受体2型在微交感切除术的小鼠中显著增加(图3)，提示微交感切除术的镇痛作用可能是从巨噬细胞的激活和浸润中产生的。每天三次静脉注射C-C趋化因子受体2拮抗剂——INCB3344显著减弱了微交感切除术的镇痛作用(图4），揭示了C-C趋化因子受体2信号通路和潜在的单核细胞/巨噬细胞浸润对紫杉醇诱导的机械性痛觉的作用。总之，局部微交感切除术后循环单核细胞和潜在浸润巨噬细胞对紫杉醇引起的神经病理性疼痛样行为起着有益的作用。

图3

图4

4、局部交感切除术促进背根神经节的抗炎作用，通过转化生长因子-β1信号通路缓解紫杉醇诱导的机械性痛觉

    紫杉醇治疗7天后，微交感切除小鼠的背根神经节中抗炎巨噬细胞标记物arginase1显著增加 (图5a)。对促炎细胞因子的影响很小或没有(图5b)。微交感切除术显著增加了白介素 10、转化生长因子-β及其受体转化生长因子-β受体1的表达(图 5c)。相反，外源重组转化生长因子-β剂量依赖性地 (图6A)显著降低了机械性痛(转化生长因子-β100ng/site在3h、1.21±0.34g VS 0.53±0.14g、n=5、P＜0.001在雄性小鼠中)(图6B)，这种降低可以被同时使用转化生长因子-β和选择性的转化生长因子-β受体1的抑制剂SB431542所逆转(图6c)。使用载体或SB431542对离体全背根神经节进行微电极记录的研究的结果显示，神经元大小是一个影响因素，SB431542只对小神经元产生影响 (图6F，G，H)。总之，以上研究提示转化生长因子-β1信号参与神经元过度兴奋性和局部微交感切除术的镇痛作用。

图5

图6