TLR4/NF-κB信号通路介导的血管炎症参与A型主动脉夹层

林镇业，王志文，孟维鑫，迟超，展旭，刘宏宇

哈尔滨医科大学附属第一医院 心脏大血管外科（哈尔滨  150001）

通信作者：刘宏宇，Email：hyliu1963@163.com

关键词：  A 型主动脉夹层；免疫炎症；Toll 样受体-4；生物标记物

引用本文：林镇业, 王志文, 孟维鑫, 迟超, 展旭, 刘宏宇. TLR4/NF-κB 信号通路介导的血管炎症参与A 型主动脉夹层的发病机制. 中国胸心血管外科临床杂志, 2019, 26(8): 748-753. doi: 10.7507/1007-4848.201811021

摘要

目的  探讨 Toll 样受体-4（toll-like receptors-4，TLR4）信号通路的活化在 A 型主动脉夹层（type A aortic dissection，TAAD）发病中的作用及其机制。方法 收集 TAAD 患者（n=12）和器官移植供体（n=12）的全层升主动脉壁组织样本；利用 Western blotting 检测 TLR4 信号通路相关蛋白表达，酶联免疫吸附法（ELISA）检测 TAAD 患者（n=43）和正常人体（n=50）的血液样品中白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的表达。结果 在 TAAD 患者的升主动脉壁内观察到 TLR4 信号通路及其主要分子的蛋白表达显著升高且伴有活化的巨噬细胞明显增多。TAAD 患者血浆中 IL-1β 表达水平上升（P<0.05），多因素逻辑回归分析和受试者工作特征（ROC）曲线分析显示血浆中升高的 IL-1β 是 TAAD 的新型独立血浆标志物。结论 活化的 TLR4/NF-κB 信号通路介导免疫炎症参与 TAAD 病理发病机制且其调控的炎症产物对 TAAD 患者具有重要的预测价值。

正文

主动脉夹层（aortic dissection，AD）是一种发病率和死亡率非常高的外科急症。 AD 的发病特点在于中膜病变，内膜撕裂而造成血液经撕裂口进入动脉壁中形成夹层。根据 Stanford 夹层分型，A 型主动脉夹层（type A aortic dissection，TAAD）累及升主动脉，也可累及主动脉弓、胸降主动脉和腹主动脉；Stanford B 型夹层累及胸降主动脉，可同时累及腹主动脉[1]。国际急性主动脉夹层注册表数据库（IRAD）显示：过去 17 年里 TAAD 手术治疗从 79% 增加到 90%。TAAD 院内死亡率显著下降（31% 至 22%），手术死亡率虽有所下降但仍维持在较高水平（25%～18%）[2]。由于对 TAAD 发病机理还不完全理解，不能获得能有效限制 TAAD 进展的药物。

过去研究表明，TAAD 主要与遗传性组织结缔性疾病相关[3]，与免疫炎症联系不紧密。然而最近研究表明，无论 TAAD 与遗传性联系紧密与否，免疫-炎症机制可能也参与主动脉壁重塑[4-6]。在 TAAD 患者中，由活化的 T 和 B 淋巴细胞和巨噬细胞组成的细胞群渗透到血管瘤周围和破裂的主动脉壁边缘。此外，已观察到 TAAD 患者的促炎细胞因子增加[7]。由此表明免疫炎症机制可能参与 TAAD 病理生理。虽然关于主动脉免疫炎症理论的研究很多，但主要集中在腹主动脉瘤（AAA），关于 TAAD 研究较少。到目前为止免疫炎症在 TAAD 发病机制中的确切作用仍不清楚。但目前发现几种有关 TAAD 的生物标志物，包括 D-二聚体、平滑肌细胞、金属蛋白酶 8 和肌腱蛋白 C[8]。

Toll 样受体-4（toll-like receptors-4，TLR4）是调控先天性免疫的重要效应分子，参与多种疾病的病理生理过程，另外已有文献指出在主动脉壁细胞中可检测 TLR4 表达，特别是在内皮细胞和血管平滑肌细胞中高表达[9]。TLR4 的这些特征表明它可能在 TAAD 中起着致病作用。本研究旨在确定 TAAD 患者中 TLR4 的表达是否增加，并确定其在 TAAD 中的作用。

1   资料与方法

1.1   临床资料

纳入 2015 年 9 月至 2018 年 1 月哈尔滨医科大学附属第一医院心脏大血管外科住院治疗的急性 TAAD 患者。入选标准为：（1）急性疾病（<14 d）；（2）AD 的诊断成像评估基于 2014 年欧洲指南[8]的建议；（3）根据斯坦福系统对胸主动脉夹层的解剖范围进行分类。如果患者有以下一种或多种情况，则将患者排除在研究之外：（1）发病时间（>14 d）；（2）可引起炎症因子水平变化的自身免疫性疾病或传染病；（3）医源性主动脉损伤、创伤性主动脉损伤和药物使用；（4）合并其他心脏疾病，如冠状动脉粥样硬化性心脏、病毒性心肌炎、心肌病、心功能不全、二尖瓣及主动脉瓣病变等；（5）某些遗传综合征，如马方综合征、Ehlers-Danlos 综合征和主动脉炎；（6）遗传性结缔组织疾病；（7）壁内血肿和穿透性主动脉溃疡；（8）伴有严重的肝肾损害。本研究经哈尔滨医科大学附属第一医院伦理委员会批准。所有患者在参与研究之前都签署了知情同意书。

1.2   组织和血浆样品

组织样本：TAAD 组为接受开放手术治疗的 12 例 TAAD 患者的全层升主动脉壁样本，其中男 8 例、女 4 例，年龄（50.4±1.97）岁。对照组在年龄和性别方面与试验组相匹配，收集 12 例由哈尔滨医科大学附属第一医院无主动脉夹层的心脏或肾脏移植供体提供的主动脉壁组织样本，其中男 8 例、女 4 例，年龄（48.5±0.69）岁。所有样本在–80℃ 下储存用于进一步试验。

血浆样本：入院后立即收集 TAAD 患者的血浆样本，所有对照都是从同一社区收集的。TAAD 组 43 例，对照组 50 例（表 1）。TAAD 组和对照组血浆样品，以 3 000 r/min 离心 5 min，分离成 500 μL 等分样品，并储存在–80℃。

1.3   Western blotting 检测

根据制造商的说明书，用含有蛋白酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific，上海，中国）的 RIPA 裂解缓冲液（Beyotime Biotechnology，上海，中国）从主动脉样本中提取蛋白。使用增强的 BCA 蛋白质测定试剂盒（Beyotime Biotechnology，上海，中国）定量总蛋白质浓度，并在 12.5% SDS-PAGE 凝胶上分离蛋白质样品。电泳后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，并与针对 TLR4（Wanleibio，沈阳，中国），MyD88（Wanleibio），TRAF-6（Wanleibio），NF-κBp65（Abcam），IL-1β（Wanleibio）和 β-肌动蛋白（ZSGB-BIO，北京，中国）的抗体一起孵育。在用 5% 无脂奶粉封闭后，将膜与适当的一抗在 4℃ 温育 24 h。洗涤 3 次后，将膜与过氧化物酶偶联的二抗（ZSGB-BIO，北京，中国）一起温育，最后化学发光试剂显色。

1.4   免疫组化（IHC）

通过 IHC 检测主动脉壁样品中 CD68 细胞（巨噬细胞）。制备福尔马林固定和石蜡包埋的切片（6 μm），并与 CD68（Abcam，Cambridge，MA，USA）的一抗在 4℃ 下温育过夜，然后用二氨基联苯胺染色，苏木精复染。用盖玻片安装切片并在光学显微镜下检查。

1.5   细胞因子检测

根据制造商的说明书（R&D Systems，北京，中国），使用酶联免疫吸附法（ELISA）测定 IL-1β 的血浆炎性细胞因子。

1.6   静脉血液指标调查

入院时在进行任何手术之前，收集所有患者静脉血。使用自动分光光度计和使用 Olympus AU640 Autoanalyzer（Olympus，Kobe，日本）的酶比色法测量 12 h 空腹血清总胆固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白。在 Hitachi 7600 Autoanalyzer（Hitachi，东京，日本）上使用 Jaffe 动力学方法进行其他生物化学测量。

1.7   统计学分析

正态分布的计量资料使用 ANOVA、独立样本 t 检验比较两组变量差异。非正态分布的计量资料组间比较采用 Mann-Whitney U 检验。 Spearman 相关分析用于评估血浆 IL-1β 以及与血浆 D-二聚体相关性。受试者工作特征（ROC）曲线用于评估血清细胞因子的诊断效果并确定相应的截止点。多因素分析采用 logistic 回归方法以确定血清 IL-1β 在 TAAD 风险中的预测值，并调整潜在的混杂因素。所有数据以中位数和四分位数表示或均数±标准差（±s）表示。统计分析采用 SPSS16.0（Chicago，IL，USA）。P<0.05 为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   在 TAAD 患者的升主动脉壁中 TLR4/NF-κB 依赖信号通路蛋白质高表达

通过 Western blotting 检测，从 TAAD 主动脉壁组织样本与对照组组织样本检测 TLR4/NF-κB 依赖信号通路的各节点分子的蛋白质水平。与对照组样本相比较，TAAD 样品显示 TLR4、Myd88、TRAF-6、NF-κBp65、IL-1β 的蛋白质表达水平显著增加；见图 1。

2.2   TAAD 患者的升主动脉壁和血浆中炎症标志物升高

通过 IHC 检验主动脉壁组织样本中的 CD68，TAAD 组中的 CD68 高于对照组，表明 TAAD 组织中巨噬细胞的显著增多（图 2）。ELISA 检测 43 例 TAAD 患者和 50 例无 TAAD 患者（对照组）血浆细胞因子 IL-1β，TAAD 组 IL-1β 水平显著高于对照组（图 3）。

2.3   TAAD 患者和对照组患者临床特征的比较

43 例 TAAD 患者的白细胞明显高于对照组［11.21（8.34～13.46）×109/L vs. 7.25（5.67～10.06）×109/L，P<0.001］，TAAD 组高血压病比例高于对照组［27（62.79%） vs. 17（34.00%），P=0.001］。此外，TAAD 组患者比对照组患者有更高的 D-二聚体水平 ［5.31（3.12～8.85）mg/L vs. 0.88（0.52～1.36）mg/L，P<0.001］。TAAD 组患者血清 IL-1β 水平为 4.03（3.20～4.97）pg/mL，高于对照组 2.74（2.05～3.87）pg/mL（P<0.001）。

2.4   血浆 IL-1β 与 D-二聚体的相关性

许多研究表明，血浆 D-二聚体与 TAAD 患者的发病率呈显著正相关，这可以作为 TAAD 发病的有效预测因子。因此，我们通过 Spearman 相关分析进一步分析了急性 TAAD 患者血浆 IL-1β 与 D-二聚体之间的关系。结果显示 IL-1β 与 D-二聚体呈正相关（图 4）。采用多因素 logistic 回归分析表明除 D-二聚体外， IL-1β 是 TAAD 显著且独立的因子［OR=2.34，95%CI（1.14，3.71，P=0.015］；见表 2。

2.5   血浆 IL-1β 和 D-二聚体在 TAAD 中的诊断价值预测

ROC 曲线分析显示 IL-1β 和 D-二聚体在 TAAD 中具有一定的诊断价值，结合 D-二聚体与 IL-1β 为最佳诊断，其次是 D-二聚体，最后是 IL-1β（图 5）。D-二聚体的曲线下面积（AUC）为 0.927［95%CI（0.858，0.968）］，灵敏度为 83.6%，特异性为 91.2%（表 3）。 IL-1β 的 AUC 为 0.806［95%CI（0.716，0.878）］，敏感性为 73.5%，特异性为 68.3%。结合 D-二聚体与 IL-1β 的 AUC 为 0.966［95%CI（0.910，0.992）］。

2.6   TLR4/NF-κB 信号通路相关蛋白与血清 IL-1β 相关性分析

Western blotting 检测表明 TLR4/NF-κB 信号通路的相关蛋白和血清 IL-1β 在 TAAD 组中均高表达，TLR4/NF-κB 信号通路相关蛋白均与血清 IL-1β 呈正相关（图 6），表明 TLR4/NF-κB 信号通路介导炎症反应参与 TAAD 发病机制。

3   讨论

有关 TAAD 的发病机制，特别是循环标志物的鉴定，仍然是研究兴趣的焦点。 虽然 TAAD 生物标志物和 TLR4 在心血管疾病中的作用已有较大发现，但 TLR4 在 TAAD 发病机制中的确切作用尚不清楚。 在本研究中，TLR4 介导的免疫途径似乎参与了 TAAD 发病的病理机制，并且 TLR4 介导的炎症产物如 IL-1β 被确立为具有重要诊断价值的新型生物标志物。

TLR4 能够识别病原体和内源性配体，并激活 NF-κB 和炎性细胞因子信号传导途径，从而激活先天免疫系统[10-13]。本研究的结果显示 TLR4 及其主要信号分子在 TAAD 的主动脉组织中过表达。这些结果表明 TLR4 的表达增加可能与 TAAD 有关。然而，很少有研究分析 TAAD 患者 TLR4 表达增加的原因和 TLR4 与 TAAD 病因的因果关系。尽管 TLR4 的表达在健康成人动脉中很大程度上是不可检测的，但它存在于主动脉壁细胞内并且在动脉损伤时增加，导致炎症反应增强。此外，主动脉壁损伤时内皮细胞和血管平滑肌细胞上的 TLR4 诱导 NF-κB 转录因子的活化以及许多炎症介质和金属蛋白酶（MMP）的产生和释放[9, 14]。巨噬细胞能够释放和调节促炎细胞因子（IL-1β）和 MMPs 的活性，这些细胞因子在导致基质降解中起到重要的作用[15]。最近的研究还表明，巨噬细胞产生内源性配体，与 TLR-4 受体结合，从而激活 NF-κB 介导的细胞迁移、激活、增殖和分化的细胞信号通路[16]。本研究结果还表明 TAAD 患者主动脉介质中巨噬细胞明显增多。在 TAAD 患者的升主动脉组织中的炎性细胞和 TLR4 的共同活化巨噬细胞，从而加强主动脉壁基质的降解。这促进了 TLR4 的释放，从而诱导 NF-κB 活化，IL-1β 的产生并增加 MMP 的表达，这可能引起主动脉壁的进一步退化。

实际上，已有研究[17]报道了腹主动脉瘤与 IL-1β 发病机制之间存在联系，并且可以通过 IL-1β 的遗传和药理学抑制来阻断主动脉瘤的形成和进展。IL-1β 与 TAAD 之间的关系仍不清楚。目前 TAAD 诊断的主要检查是主动脉 CT 血管造影（CTA）[18]，磁共振成像（MRI）也是主动脉夹层检查重要项目，其灵敏度为 95%～98%，特异性为 94%～98%[19]。但主动脉 CTA 和 MRI 不是急性胸痛患者常规检查项目，而且存在转运风险。MRI 成像时间长，不适合急危重患者，无法急诊实施，并限制了体内金属异物、起搏器植入术的患者。CTA 增强扫描需要注射对比剂，需护理协作，基层医院在夜间常规开展存在困难。而结合患者病史、症状、体征和生物标记物进行早期诊断，可能成为今后研究方向。本研究表明，血浆 IL-1β 升高可作为 TAAD 的独立危险标志物。目前已经确立 D-二聚体是 TAAD 风险预测因子，但 D-二聚体升高也可能提示肺栓塞[8]；同样，IL-1β 升高也可能提示其他疾病。因此，联合多种生物标志物对 TAAD 的诊断更为准确，本次研究 ROC 曲线分析同样也证明这一点，结合 D-二聚体与 IL-1β 评估为最佳的诊断。