文献精读 | ⼤⿏模型中通过冰浆注射选择性神经阻滞达到持续性、无成瘾性镇痛

    术后持续性疼痛是外科⼿术(如全膝关节成形术、开胸⼿术和疝修补术)后的主要问题。⼤多数持续性术后疼痛包括由外科手术区域的周围神经损伤引起的神经病理性疼痛。⽬前的临床上治疗⽅法包括局部麻醉药和阿⽚类药物，前者镇痛持续时间短，后者则具成瘾性。由于目前阿⽚类药物成瘾已成十分普遍，因此探索发展无成瘾性疼痛治疗法已成为医学上的⾸要任务。冷冻神经阻滞术是⼀种通过直接降温来可逆地抑制周围神经功能数周⾄数⽉的⽅法，已成为术后多模式镇痛⽅法的一部分。该技术通常使⽤针头或冷冻探针在–60°C 或更低的温度对⽬标周围神经进⾏接触降温，但是这种极限低温对于周边任何组织都会产生损伤，不具有选择性的，外加操作费时，镇痛效果依赖于操作者的技术，导致⽬前的冷冻神经阻滞术应用极大地受限。因此，在本研究中，研究者使用了⼀种能够选择性地对周围神经组织进行神经阻滞术的可注射冰浆，解决了当前冷冻神经阻滞术治疗⽅法的⼀些不足。

    由于冰的熔化热数值高(334J/g)，即冰在熔化成冰浆时吸收的能量高。研究者利⽤冰浆悬浮液中冰粒的相变特性，发明了⼀种新的局部组织降温⽅法，并已在猪的动物模型中证实其可安全、选择性有效地靶向富含脂质的组织。在本研究中，使用了由生理盐水、甘油和悬浮无菌冰粒组成的一种⽣物相容性冰浆（−5°C 左右)，选择性地使周围神经组织降温。

    本研究⽬的是确定冰浆是否可作为⼀种新的、可注射的、⽆药物的、组织选择性的神经冷冻治疗⽅法来减轻疼痛。作者推测可通过在⼤⿏坐⻣神经周围选择性注射冰浆进行神经阻滞术改变痛阈基线值，并通过评估大鼠对伤害感受反应的程度来得出初步结果。评估指标包括：髓鞘和轴突结构完整性，以及对坐骨神经介导的相关神经功能。此外，作者还发现在实施冰浆冷冻神经阻滞术后不同时间点中，神经功能损伤与结构改变之间的关系。

研究对象：

    本研究使⽤了 62 只7-8周左右大小的雄性SD⼤⿏，实验组在坐骨神经周围注射15ml混合了冰粒的冰浆溶液（-3.5℃至-5℃），对照组则注射与冰浆溶液成分相同的等量常温溶液。研究者通过光学显微镜、相干反斯托克斯拉曼散射显微技术（Coherent anti-Stokes Raman Scattering microscopy, CARS）、免疫荧光及组织形态学计量在注射后第7，14，28，56和112天观察组织形态学；通过趾展行为、运动功能测试、机械伤害性反应及热痛敏测试在注射后每隔1-3天观察神经功能。

1. 冰浆溶液能够安全的、选择性地阻滞坐⻣神经。

    作者使⽤皮下注射针将冰浆注⼊包含坐⻣神经的腔隙中，使⽤热电偶监测注射区域温度，注⼊冰浆后组织温度从 33°C 迅速降⾄-5°C；保持零下温度状态⾄少 6.5 分钟，在此期间伴随着冰融化（图 1A）。术后即时及后续检查⼤⿏皮肤均未观察到坏死或溃疡，HE染色中也未观察到肌⾁和⽪肤组织存在损伤（图 1B）。皮肤、肌肉及神经阻滞中组织形态学结果中也无纤维化或瘢痕形成相关表现。

▲ Figure 1

2.冰浆注射诱导神经髓鞘产生可逆性损伤。

    作者使⽤CARS观察冰浆注射对包绕神经轴突外的髓鞘形态和神经组织结构的影响。注⼊冰浆导致坐⻣神经纤维的髓鞘破裂，注射后第 7 天组织出现组织⽔肿和形态学紊乱（图 2）。注射后第 7、14 和 28 天的图像中，形态学上被定义为巨噬细胞的细胞吞噬损伤髓鞘中的脂滴。髓鞘再生和神经组织重构在第 14至28 天间表现显著，在治疗后第 112 天，神经组织和髓鞘结构完全恢复（图 2A）。对照组⼤⿏注射室温溶液，未观察到此类变化(图 2B），表明降温冷冻是造成对照组和实验组结果差异的原因。校正的相关参数（corrected correlation parameter, CCP）指数⽤于量化髓鞘结构中的组织化程度，其中数值“0” 表示组织被完全破坏，“1” 则表示髓鞘组织完整。在进行冰浆注射后第14天，CPP由基线值 0.83±0.10降⾄最低0.34±0.19(降幅达60%，P=0.0001)，注射后第 112 天逐渐恢复⾄正常⽔平(P=0.86±0.10）（图 2B）。

▲ Figure 2

3. 冰浆注射使神经轴突密度及神经髓鞘厚度出现可逆性下降。

    研究者采⽤免疫荧光，观察注射后不同时间(第 7、14、28、56、112 天)神经组织标本的形态学变化，观察冰浆注射对神经组织结构、轴突密度、施万细胞和髓鞘的影响。使⽤ NF200 标记轴突，S100标记施万细胞，髓鞘碱性蛋⽩标记髓鞘。结果表明，注射后第 7 天，神经轴突密度降低，正常神经组织结构被破坏，髓鞘结构损伤（图 3A）。轴突密度从基线的 14 个/1,000µm2降⾄第 7 天的 10.5个/1,000µm2(降幅达 25%，P<0.0001)，但在第 112 天完全恢复（图 3B）。

    与CARS检测相似，髓鞘的免疫荧光结果在第 112 天显示可逆性恢复（图 3A)。对甲苯胺蓝染⾊的神经组织对有髓神经纤维变化进⾏形态计量学分析。注射后第 7 天出现轴突退化(图 3C)，注射后第 14 天，轴突周围髓鞘明显缺失，粗⼤的轴突出现脱髓鞘。对轴突密度进行量化后显示，冰浆注射导致轴突密度从基线的 14.5个/1,000µm2轴突降⾄第 7 天的 10个/ 1,000µm2轴突(降幅达31%，P<0.0001)，同样第 112 天完全恢复(图 3D)。对神经纤维和轴突直径进⾏组织形态分析并计算髓鞘厚度，结果显示髓鞘厚度从基线的 1.4 µm 大幅降低到第 7 天的 0.76µm(降幅达 48%)，第 112 天逐渐完全恢复⾄ 1.50 µm（图 3E）。值得注意的是，髓鞘厚度的下降趋势较神经轴突密度下降趋势大(48%vs.25%)，恢复⾄基线值的速度更慢(112 天 vs.56 天)。在对照组中，注射室温溶液的⼤⿏在免疫荧光或甲苯胺蓝染⾊结果中均未显示任何异常(图 3 B, D, E)。

▲ Figure 3

4. 冰浆注射诱导产生⻓期、可逆的神经功能损伤。

    研究者通过趾展运动和行走运动功能试验评估冰浆注射对神经功能的影响。注射冰浆后第 1 天趾展反射消失，在第 27 天恢复接近正常⽔平(图 4A)。第 1 天运动功能障碍达到最⼤值，在第 22 天完全恢复(图 4B)。注射后第 10 ⾄ 14 天，与基线值之间无统计学差异。注射室温溶液的对照组⼤⿏未观察到相关运动功能变化。进⾏机械性痛敏试验和热痛敏试验评价冰浆注射对感觉伤害功能的影响。注射冰浆后第 8 天，通过缩⽖频率观察到大鼠对于机械性刺激后疼痛反应显著降低(P=0.001)。与基线值相⽐，冰浆注射后的机械痛觉阈值持续下降至注射第 60 天，期间在第 22 天达到最大降幅68% (图 4C)，半恢复期为 9~10 周。接受室温溶液注射的对照组⼤⿏进⾏机械性痛敏试验，与基线相⽐无显著变化(⻅补充数据)。注射后第 8 天⾄第 60 天，实验组和对照组的机械痛觉阈值有显著差异(图 4D)。与机械刺激不同，实验组和对照组的热痛敏试验均未显示显著变化。

▲ Figure 4

    综上所述，本研究证实了安全使⽤可注射冰浆冰粒悬液对⼤⿏周围神经进⾏组织选择性冷冻神经阻滞术以减少机械性伤害的可⾏性。坐⻣神经周围单次注射−5°C 冰浆能产生可逆性破坏髓鞘结构持续⾄少 8 周，降低轴突密度 2~4 周，抑制运动功能 3~4 周，抑制点状痛觉功能 8 周。本研究的局限性之⼀是功能研究(趾展试验、运动功能试验、机械性痛敏试验和热痛敏试验)未使⽤盲法。经过处理的后⽖的直接物理外观导致⾏为测试观察者的有效实验⽆法进⾏盲法，⼤⿏在接受冰浆注射⼏周内⽆法使⽤该后⽖站⽴或⾏⾛。对照组的⼤⿏身体未受到影响，拥有正常站姿和运动功能。此外，结构变化和功能损伤之间的联系值得注意。运动功能障碍在注射后第 1 天达到最⼤，第 27 天恢复，⽽机械伤害性感觉减少在第 8 天才检测到，并持续到第 56 天(图 4C)。当设计⼈体试验性研究以测试此疗法是否安全有效时，伤害性感觉阈值下降的延迟性应被考虑在内。根据⼈体研究的结果调整治疗的时机，以优化术后疼痛的缓解。如上所述，轴突密度下降在第 7 天达到最⼤值(25%~31%)，⾄少持续 28 天，⽽髓鞘结构和厚度损伤在第 7 天最严重(50%~60%)，⾄少持续 56天。运动功能和轴突密度恢复至正常水平较快，机械性痛觉阈值在髓鞘再形成之后恢复正常。热痛敏通常被认为是由⽆髓 C 纤维介导，不受冰浆注射的影响。在未来的研究中，对于无髓鞘神经纤维在注射后第⼀周的相关结构变化需进⼀步关注，这对与完善结构-功能的关系是十分必要的。

    与⽬前使⽤的冷冻神经阻滞镇痛⽅法相⽐，可注射冰浆具有多⽅⾯优势。包括：(1)⽪下注射针和注射器可注射冰浆冰粒悬液；(2) 冰浆能渗透到组织中增加使目的神经组织降温的可能性；(3)冰浆因其温度仅损伤脂质丰富组织从而达到选择性产生神经阻滞作用，而不破坏其他肌肉、皮肤等组织。因此，使⽤可注射冰浆冰粒悬液能选择性对神经组织进行阻滞传导，从⽽到达减轻术后疼痛目的，以提供持久、⽆成瘾风险且⽆药物的治疗⽅法。