文献精读 | 人类脊髓μ-阿片受体1Y亚型和胃泌素释放肽受体间的相互作用介导阿片类药物诱发的搔抓行为

经脊髓途径应用阿片类药物已成为围手术期急性疼痛和慢性疼痛等临床疼痛管理的主要手段，包括鞘内和硬膜外两种途径。经脊髓使用阿片类药物更易发生瘙痒，显著降低患者满意度，然而其机制仍不清楚。

编码MOR的Oprm1基因在啮齿动物和人类中包含许多选择性剪接变体或亚型，有些与镇痛无关，有些和阿片类药物个体差异有关。大多数Oprm1亚型的C末端不同，这可能是其功能差异的基础。胃泌素释放肽受体（GRPR）是一种Gq蛋白偶联受体，它在脊髓背侧表达，其内源性神经肽配体-胃泌素释放肽在感觉神经元中表达。GRPR是脊髓中的重要受体，将非组织胺性瘙痒从周围传导至大脑。与Oprm1亚型不同的是，尚未在小鼠或人类中发现GRPR剪接变体。

小鼠的研究中证实了经脊髓使用阿片类药物诱发瘙痒的机制是激活MOR1D亚型并交叉激活了脊髓GRPR神经元。而阿片类药物的镇痛是通过那些不在GRPR神经元中表达的MOR1亚型所介导的。在灵长类动物中，已证明鞘内胃泌素释放肽可诱导搔抓行为，但不影响痛觉。此外，具有慢性瘙痒的老年灵长类动物表现出感觉神经元中胃泌素释放肽的表达增加以及脊髓中胃泌素释放肽受体的表达增加。这些研究表明，啮齿动物和灵长类动物的GRPR特异性瘙痒信号传导通路具有进化保守性。尚不清楚这是否也是人经脊髓使用阿片类药物诱发瘙痒的机制。

在本研究中，作者验证了人类经脊髓应用吗啡是通过Oprm1剪接变体和GRPR之间的相互作用诱发瘙痒，其方式类似于小鼠中已确立的MOR1D和GRPR相互作用。证实了人类脊髓中存在多个Oprm1亚型，MOR1Y交叉激活GRPR从而导致阿片类药物介导的瘙痒。这些发现对在不影响镇痛效果下治疗瘙痒具有重大意义。

1、    人体标本

人脊髓标本来自两具捐献的冷藏尸体。

2、    氨基酸序列比对

人MOR1（hMOR1;  NP_000905.3），鼠MOR1（mMOR1;NP_001289722.），人GRPR(hGRPR; NP_005305.1)和鼠GRPR(mGRPR;NP_032203.1)进行线性氨基酸序列比对

3、    人Oprm1亚型的鉴定

作者设计了异构体特异性逆转录聚合酶链式反应引物，并使用人脊髓标本进行了RT-PCR。表1列出了剪接变体特异性引物的序列。pcDNA3.1 / hMOR1，hMOR1B1，hMOR1B3，hMOR1B5，hMOR10，hMOR1X和hMOR1Y质粒由Dr.Y.X. Pan，M.D.，Ph.D.提供;pcDNA / hGRPR由Dr. James Battey提供。将hMOR1A、hMOR1B2和hMOR1B4的剪接变体特异性3'末端氨基酸序列整合到反向引物中，并通过IDT合成。使用PCR从hMOR1模板扩增完整的cDNA片段，并将其亚克隆到Nhe I和Xba I位点间的pcDNA3.1中。通过DNA测序验证所有质粒。

4、细胞培养与转染

使用含10％胎牛血清的改良培养基培养HEK 293细胞。首先用含有新霉素耐药性的pcDNA3.1 / hGRPR（20 µg / 107细胞）转染HEK 293细胞。在500 µg / ml G418的存在下选择稳定的转染子。将细胞进行第二轮转染，培养共表达两种受体的品系，并在500 µg / ml G418和100 µg / ml潮霉素存在下进行选择。生成hGRPR，hMOR1B1，hMOR1Y，hMOR1B1 / hGRPR和hMOR1Y / hGRPR的克隆表达。

5、钙离子成像

为明确人MOR1剪接变体和GRPR间的相互作用，作者在HEK 293细胞上进行了钙离子成像，然后测试了hGRPR和不同人Oprm1 C末端剪接变体之间的功能性的相互作用。将稳定表达hGRPR的HEK 293细胞接种在涂有多聚赖氨酸的盖玻片上。使用脂质体3000转染了不同人Oprm1 C末端剪接变体的质粒（1 µg/玻片）。转染24h后，对细胞进行钙离子成像。在行钙离子成像前，用纳曲酮（10 µM）和GRPR拮抗剂（1 µM）预培养15分钟。

6、转录肽反式激活因子

hMOR1的C末端剪接变体从M1到Q388都有相同的氨基酸序列。每个变体都有一个特异性的C末端，可以解释其特异性功能的产生。为了选择性抑制特定的Oprm1亚型，作者合成了含有（YGRKKRRQRRR）的转录-融合肽的反式激活因子，将其融合到hMOR1Y亚型特异性C末端（IRDPISNLPRVSVF）。作者为Oprm1亚型合成了一个转录融合肽的反式激活因子，该亚型可在脊髓中检测到并在钙离子成像中表现出GRPR特异性共杂交。转录融合肽的反式激活因子的引入允许它们与相应的受体在体外及体内和hGRPR产生相互作用。

7、动物研究

将19只小鼠随机分为3组（hMOR1Y转录反式激活因子分别为0、0.1和0.4nmol），用于观察吗啡诱导的搔抓行为和镇痛效果。21只小鼠被随机分为3组（hMOR1Y转录反式激活因子分别为0、0.1和0.4nmol），用于观察胃泌素释放肽诱导的搔抓行为。通过鞘内注射生理盐水或不同剂量hMOR1Y转录反式激活因子（0.1 nmol和0.4 nmol）在脊髓水平来检验转录融合肽反式激活因子的作用。按分组行椎管内注射吗啡或胃泌素释放肽。然后对小鼠行搔抓行为试验及热甩尾试验。

1、确定人脊髓中Oprm1剪接变体

为确定人脊髓中Oprm1的剪接变体，作者从人脊髓的背角和腹角分离出cDNA。通过使用逆转录聚合酶链反应，明确检测到相应的hMOR1，hMOR1A，hMOR1B5和hMOR1Y的条带（图1A） 在脊髓腹角中，存在hMOR1和hMOR1A的逆转录聚合酶链反应带，表明这两个变体广泛表达（图1B）。在人脊髓背角中也存在一个与hGrpr相对应的条带（图1C）。逆转录聚合酶链反应结果表明，有多种hMOR剪接变体在人脊髓中表达（图1A）。

2、人MOR 1Y可以交叉激活GRPR信号通路

作者先前的研究表明吗啡通过激活小鼠MOR1D–GRPR的相互作用来介导瘙痒信号传导。值得注意的是，人和小鼠MOR和GRPR的氨基酸序列是高度保守的。（图1、D和E）。因此，确定人Oprm1剪接变体以类似小鼠MOR1D的方式与GRPR产生相互作用的关键在于，当使用吗啡后，表达GRPR的HEK 293细胞的亚型可以介导钙瞬变。在人脊髓背角中检测到的五个剪接变体中，只有hMOR1Y能在吗啡应用后交叉激活hGRPR的钙信号传导（图2A）。当其他剪接变体与hGRPR共表达时，吗啡不能引起钙信号传导（图2B和数据补充1，http：//links.lww.com/ALN/B956）。相反，当单独用hMOR1Y或hGRPR转染HEK 293细胞时，吗啡中不会引起钙信号传导（图2C）。纳曲酮在灵长类动物中能够抑制吗啡介导瘙痒的μ-阿片受体拮抗剂,使用纳曲酮预培养细胞，在hGRPR / hMOR1Y细胞中，吗啡诱导的钙发放被完全阻断（平均差为56±3nM）（图3，A和B，红色）。吗啡诱导的钙发放也会被GRPR拮抗剂阻断（平均差为54±3nM）（图3，A和B，蓝色）。这些数据表明，hMOR1Y能够介导吗啡对hGRPR交叉激活的作用。

3、hGRPR信号通路的交叉激活需要hMOR1Y的C末端

先前研究表明，小鼠MOR1D C末端中的7个氨基酸序列对于MOR1D 和 GRPR间的相互作用是至关重要的，因为Tatpeptide可以减弱MOR1D和GRPR之间的交叉信号传导。为了测试hMOR1Y和hMOR1B1是否可以通过其C末端交叉激活hGRPR，作者合成了转录-融合肽的反式激活因子，包含1个转录的反式激活因子（YGRKKRRQRRR），可以和hMOR1Y (IRDPISNLPRVSVF)的C末端融合，从而证实了其与hGRPR的相互作用，并检验了是否转录肽的反式激活因子可以减弱和hGRPR之间的相互作用。首先用表达hGRPR/hMOR1Y的HEK293细胞培养转录-hMOR1Y的反式激活因子。值得注意的是，在表达hGRPR / hMOR1Y的细胞中，预培养2h hMOR1Y-转录反式激活因子会剂量依赖性地阻断了吗啡所介导的钙离子反应（平均差，28±2 nM，载体 vs. 50μM；66±2 nM，载体 vs.200μM）（图3，C和D）。高浓度的Tat-hMOR1Y（200 μM）也表现出抑制胃泌素释放肽引起的钙反应（平均差，12±2nM）(图3，C和D）。这些结果表明，hMOR1Y的C末端可能直接与hGRPR有交互作用。

4、hMOR1Y的C末端概括了mMOR1D对小鼠瘙痒和镇痛的作用

hMOR1Y-转录反式激活因子可以阻断hMOR1Y和hGRPR的相互作用这一发现支持了两个重要的概念。首先，人和小鼠间的GRPR具有高度保守性（图，1E）。其次，hMOR1Y和mMOR1D的C末端可能共有重要的生化特性，使其在任何物种中都能交叉激活GRPR（表2）。为进一步研究这一点，作者测试了hMOR1Y-转录反式激活因子对鞘内注射吗啡或胃泌素释放肽诱发的小鼠搔抓行为的影响。值得注意的是，hMOR1Y-转录反式激活因子剂量依赖性地减弱了吗啡诱导的搔抓行为，且对吗啡介导的抗伤害感受没有影响（平均差，24± 16，0 nmol  vs.  0.1 nmol;54 ± 17，0 nmol  vs.  0.4 nmol） （n = 每组 6 至 7 只小鼠;P  = 0.011，单向方差分析）（图，4B）。hMOR1Y-转录反式激活因子也会阻断胃泌素释放肽介导的搔抓行为（平均差，20±18，0 nmol vs. 0.1 nmol;6 ± 18，0 nmol vs. 0.4nmol） （n = 每组7只小鼠;  P  = 0.013，单向方差分析）（图，4C）。这些结果表明，hMOR1Y-转录反式激活因子可能直接阻断小鼠GRPR功能。为证实这一观点，作者对共表达mMOR1D / mGRPR的HEK 293细胞进行了钙成像。预培养2h hMOR1Y-转录反式激活因子可以显著阻断吗啡和胃泌素释放肽所介导的钙发放。降低其钙离子峰电位（平均差，101±6 nM，吗啡；103±4 nM，胃泌素释放肽）（图.4，D和E）。因此，hMOR1Y-转录反式激活因子可以在MOR1D / GRPR神经元中充当GRPR拮抗剂。总之，hMOR1Y在脊髓背角的表达及其与hGRPR的相互作用表明，hMOR1Y可能在吗啡介导的瘙痒中起重要作用。

首先，作者证实了hGRPR在人类脊髓中的表达。其次，证明Oprm1基因在人的脊髓中进行了广泛的可变剪接，在脊髓的腹角和背角之间存在明显的区域差异。令人惊讶的是，人脊髓中Oprm1的剪接变体表达模式的区域变化也反映了小鼠脊髓的情况 ，进一步支持了Oprm1剪接变体在整个动物物种中都保持高度保守的观点。第三，作者的数据表明，hMOR1Y和hGRPR存在相互作用，而hMOR1Y的C末端是GRPR介导的瘙痒感觉传导的交叉激活所必需的。这一发现使人想起了小鼠脊髓中MOR1D–GRPR的相互作用，强烈表明了小鼠和人之间阿片类药物诱导的瘙痒通路的功能保守性。hMOR1Y-转录反式激活因子可以作为GRPR拮抗剂，并在没有吗啡但存在hMOR1Y的情况下发挥其抗GRPR信号转导作用。这些发现意味，仅hMOR1Y的存在可能会改变hGRPR的构象和功能，从而使hMOR1Y-转录反式激活因子能够干扰胃泌素释放肽与GRPR的结合。

该研究的发现有两个重要的临床应用。首先，该研究提供了治疗或预防人经脊髓使用阿片类药物引发的瘙痒潜在的药理学靶点，从而研发一种可以和阿片协同使用的药物。可以采用这两种新的药理学策略来处理阿片类药物诱发的瘙痒。首先，可以联合应用吗啡与GRPR拮抗剂来靶向结合GRPR。此外，通过联合应用吗啡和与hMOR1Y C末端靶向结合的转录肽反式激活因子，可以明确减轻阿片类药物诱发的瘙痒。这些方法较目前使用阿片类药物拮抗剂或抗组胺药治疗阿片类药物引起的严重瘙痒更可取，因为这些药物充其量仅部分有效。其次，在人脊髓中发现多种剪接变体提出了一个重要的问题-即它们在人类中的特异性功能，这问题至今仍未知。克服阿片类药物在镇痛管理中局限性的主要是如何在不影响其镇痛效果下减少不必要的副作用。不同的Oprm1亚型的激活可能是阿片类药物在镇痛管理中某些副作用发生的原因。因此，这些发现可能预示着未来阿片类药物在发挥镇痛效果时可以摆脱其他副作用（如成瘾性和呼吸抑制）

   
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