抑癌基因甲基化联合检测与肺癌早期诊断

2020
09/27

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华西医院胸心外科杂志
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多基因甲基化联合检测在肺癌早期诊断中具有重要意义,具有广阔的临床应用前景。

刘展1,张真榕2,刘德若2

1. 北京大学中日友好临床医学院 中日友好医院 胸外科(北京  100029)

2. 中日友好医院 胸外科(北京  100029)

通信作者:刘德若,Email:deruoliu@vip.sina.com

关键词:  肺癌;早期诊断;甲基化;联合检测

引用本文:刘展, 张真榕, 刘德若. 抑癌基因甲基化联合检测与肺癌早期诊断. 中国胸心血管外科临床杂志, 2019, 26(8): 810-814. doi: 10.7507/1007-4848.201811006

摘要

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤,也是癌症相关死亡的主要原因。由于缺乏有效的早期诊断方法,肺癌预后较差,但与晚期肺癌相比,早期肺癌生存率大大提高。因此,早期诊断肺癌至关重要。作为一种主要的表观遗传学修饰,DNA 甲基化在肺癌发生发展过程中发挥着重要作用。大量研究表明,抑癌基因甲基化检测是一种理想的肺癌早期诊断方法。随着检测技术的不断进步,可以实现多种基因的甲基化检测。研究发现多基因甲基化联合检测在穿刺病变组织、穿刺淋巴结组织等微创操作获取的组织样本以及外周血、支气管肺泡灌洗液、痰液等无创样本中均具有较高的检出率,并且较单一基因甲基化检测灵敏度及特异度更高,是一种理想的肺癌早期诊断方法。

正文

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤,也是癌症相关死亡的主要原因[1]。在我国肺癌发病率及死亡率均居恶性肿瘤首位[2]。肺癌预后较差,5 年生存率仅为 16.1%[3],而早期肺癌患者 5 年生存率可达 90%[4]。因此,肺癌早期诊断至关重要。

DNA 甲基化检测是肺癌的一种主要早期诊断方法。DNA 甲基化是指在 DNA 甲基转移酶的作用下,以 S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体,将甲基基团转移到胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸中胞嘧啶的第 5 位碳原子上[5],其在肺癌发生发展过程中发挥着重要作用,尤其是抑癌基因启动子区域 CpG 岛的异常甲基化可以导致抑癌基因的沉默,进而影响肿瘤的发生发展[6]。同时 DNA 较 RNA 及蛋白质性质稳定,且基于聚合酶链式反应(PCR)的 DNA 甲基化检测技术可以大大提高检测灵敏度,此外抑癌基因甲基化在穿刺病变组织、穿刺淋巴结组织等微创操作获取的组织样本及外周血、支气管肺泡灌洗液、痰液等无创样本中均有较高的检出率,因此抑癌基因甲基化在肺癌早期诊断中具有广阔的应用前景。

大量研究表明,SHOX2、RASSF1A、p16、CDH13 等抑癌基因甲基化与肺癌早期诊断密切相关[7-10],但其灵敏度及特异度相对较低。而肺癌的发生发展是由多种基因共同参与的多步骤的复杂过程,多种抑癌基因在细胞信号转导、周期调控、增殖分化、粘附、凋亡、DNA 修复等方面发挥着重要的作用。研究表明,抑癌基因甲基化发生于肺癌的不同时期[11],因此单一基因甲基化检测不足以诊断肺癌。并且随着高通量检测技术的不断发展,可以实现多种基因的甲基化检测。众多研究表明,多基因甲基化联合检测在穿刺病变组织、淋巴结组织等微创操作获取的组织样本及外周血、支气管肺泡灌洗液及痰液等无创样本中均有较好的检出率,并且与单一基因甲基化检测相比,检测肺癌的灵敏度及特异度更高。因此,本文就抑癌基因甲基化联合检测在肺癌早期诊断中的应用做一综述。

1   组织中抑癌基因甲基化联合检测与肺癌早期诊断

1.1   手术切除组织

大量研究表明,组织中抑癌基因甲基化与肺癌密切相关,并且多基因甲基化联合检测可以显著区分组织良恶性。多项研究表明,手术切除组织中多基因甲基化联合检测肺癌的灵敏度为 65.38%~92%,特异度为 84.62%~100.0%[12-15]。

Nawaz 等[12]从 38 种抑癌基因中筛选出 HOXA9、TBX5、PITX2、CALCA、RASSF1A、和 DLEC1 等 6 种灵敏度及特异度较高的抑癌基因组成甲基化检测模板。利用多重甲基化特异性 PCR(MMSP)技术对 70 例非小细胞肺癌患者的肿瘤组织及相应正常肺组织中的 6 种基因进行甲基化检测,发现单一基因甲基化检测非小细胞肺癌的灵敏度为 37%~87%,特异度为 86%~99%,而至少 2 种抑癌基因发生甲基化可以显著区分肺癌组织及正常肺组织,其检测肺癌的灵敏度为 87%,特异度为 94%,显著优于单一基因甲基化检测。并且在早期肺癌中也具有良好的检出率,灵敏度为 86%,特异度为 100%。Zhang 等[13]利用甲基化特异性 PCR(MSP)对 78 例非小细胞肺癌患者的肿瘤组织及瘤旁正常组织中的 20 种基因进行甲基化分析,且定义 CPG 岛甲基化表型(CIMP)为至少 4 种基因甲基化。发现 CIMP 可以显著区分组织良恶性,肿瘤组织中 CIMP 阳性率为 65.38%,而瘤旁正常组织中 CIMP 阳性率仅为 1.28%。可见,手术切除组织中多基因甲基化联合检测可以显著区分肿瘤组织及正常肺组织,这为多基因甲基化联合检测在肺癌早期诊断中的应用提供了理论基础。

1.2   穿刺病变组织

CT 引导下肺部结节穿刺活检是目前胸部 CT 上发现可疑结节患者的主要早期诊断方法,其可以直接获取组织,但受结节大小、位置、穿刺人员技术等原因的限制。Gao 等[16]利用定量甲基化特异性 PCR(QMSP)技术对 39 例肺癌患者的穿刺组织中的 APC 及 RASSF1A 基因进行甲基化分析,发现肺癌组织中 APC 基因甲基化检出率为 59%,RASSF1A 基因甲基化检出率为 66.7%,而两种基因联合检测可以检出 69.2% 的肺癌患者。虽然检出率相对较低,但是基因甲基化联合检测可以用于穿刺组织的辅助病理诊断。目前穿刺组织中甲基化检测研究较少,需要进一步研究来证实其在肺癌早期诊断中的价值。

1.3   癌前病变组织

肺癌癌前病变中多基因甲基化联合检测在肺癌早期诊断中也具有重要意义。Licchesi 等[17]利用多重巢式甲基化特异性 PCR 对 16 例多发非典型腺瘤样增生(AAH)患者的 AAH 病灶、邻近正常肺组织和同时存在的肺腺癌组织中的 7 种基因(p16、TIMP3、DAPK、MGMT、RARβ、RASSF1A 和 hTERT)进行联合甲基化分析。发现邻近正常肺组织中基因甲基化平均数目为 0.67,低级别 AAH 中基因甲基化平均数目为1.30,高级别 AAH 中基因甲基化平均数目为 2.67,腺癌组织中基因甲基化平均数目为 3.72。基因甲基化的平均数目随着疾病的发展而逐渐增加,这提示甲基化数目可以辅助组织学诊断。并且单一基因甲基化的绝对危险度(OR)值为 5.39~11.38,而至少 4 种基因发生甲基化的患者发生肺腺癌的风险是少于 4 种基因甲基化患者的 18.66 倍。因此,基因甲基化联合检测可以识别肺腺癌的高危人群,从而早期发现肺腺癌患者。

1.4   淋巴结组织

超声内镜引导下支气管针吸活检术(EBUS-TBNA)可以对可疑淋巴结进行穿刺活检,是肺癌的一种主要诊断方法。对穿刺淋巴结组织中基因甲基化进行联合检测,可以辅助病理诊断,从而早期诊断肺癌。Millares 等[18]利用甲基化敏感性高分辨率熔解(MS-HRM)技术对通过 EBUS-TBNA 获取的 90 个淋巴结进行 DAPK、p16、RASSF1、APC 和 CDH13 等 5 种基因的甲基化分析,发现 67% 的转移淋巴结中可以检出至少一种基因的甲基化。并且在 53 例非小细胞肺癌患者中,APC 基因甲基化检出率为 30.2%,P16 基因甲基化检出率为 17%,而 2 种基因甲基化联合检测可以检出 39.6% 的非小细胞肺癌患者,优于单一基因甲基化检测。但是其检测灵敏度相对较低,且目前淋巴结组织中基因甲基化研究相对较少,其在肺癌早期诊断中的应用价值需要进一步研究验证。

2   外周血中抑癌基因甲基化联合检测与肺癌早期诊断

在肿瘤发生发展过程中,肿瘤细胞可以释放 DNA 进入血液循环,因此可以在外周血中检测到 DNA 的甲基化[19]。并且有研究表明,肿瘤组织及外周血样本中基因甲基化的检出水平具有良好的一致性,两种样本中 9 种抑癌基因甲基化水平的 Kappa 值为 0.758~0.906[13]。这提示外周血样本中甲基化联合检测可以用于肺癌早期诊断。

Weiss 等[20-21]利用实时 PCR(RT-PCR)技术对三项独立病例-对照研究中的 330 例患者血浆样本进行 SHOX2 和 PTGER4 基因甲基化检测,发现 SHOX2 和 PTGER4 基因甲基化组成的模板可以显著区分肺癌患者及非恶性肿瘤患者,并在包含 172 例患者血浆样本的验证试验中得到了证实。其曲线下面积(AUC)为 0.88。灵敏度为 90% 时,特异度为 73%,特异度为 90% 时,灵敏度为 67%,显著优于由 CEA、CYFRA21-1、CA-125、CA-19-9 等传统血浆蛋白标志物组成的模板(AUC 为 0.79)。Hulbert 等[22]的研究也得到相似的结论,他们对肺 CT 上可见结节的 150 例Ⅰ~ⅡA 期肺癌患者及 60 例非肿瘤患者血浆样本中的 SOX17、TAC1、HOXA7、CDO1、HOXA9 和 ZFP42 等 6 种基因进行甲基化分析。筛选出灵敏度及特异度较高的 CDO1、TAC1 和 SOX17 等 3 种基因,其灵敏度分别为 65%、76% 和 73%,特异度分别为 74%、78% 和 84%。而 3 种基因联合检测检出肺癌的灵敏度为 86%,特异度为 78%,优于单一基因甲基化检测。

外周血样本获取方便,操作简便,并且可以重复采集,这都提示外周血可以作为肺癌早期诊断的一种理想的检测样本。但是血液样本中 DNA 含量相对较少,肿瘤负荷较小,并且缺乏器官特异性。随着检测技术的不断进步,DNA 扩增技术不断成熟,外周血样本在肺癌早期诊断中具有广阔的临床应用前景。

3   支气管肺泡灌洗液中抑癌基因甲基化联合检测与肺癌早期诊断

目前纤维支气管镜检查广泛应用于临床,支气管肺泡灌洗液获取简便,并且允许局部采样,相对靠近肿瘤细胞,定位相对准确,特异性较强,是肺癌生物标志物的主要替代来源。并且 Ma 等[14]的研究发现,PCDHGB6,HOXA9 和 RASSF1A 组成的甲基化联合检测模板在肿瘤组织中可以检出 92% 的非小细胞肺癌患者,而在支气管肺泡灌洗液中的灵敏度可以达到 80%。可见支气管肺泡灌洗液与肿瘤组织具有较好的一致性,是一种理想的早期诊断样本。

Ren 等[23]应用实时甲基化特异性 PCR(RT-PCR)技术对 305 例支气管肺泡灌洗液样本中的 SHOX2 和 RASSF1A 基因甲基化进行检测,发现肺癌组 SHOX2 和 RASSF1A 甲基化阳性率分别为 64.2% 和 50.4%,明显高于对照组(7.7% 和 3.8%)。而将两种基因化进行联合分析发现,肺癌组阳性检出率由 64.2% 和 50.4% 提高到 71.5%。这提示 SHOX2 和 RASSF1A 基因甲基化的联合检测有很好的鉴别肺部良恶性疾病的潜力。Zhang 等[24]的研究也得到了相似的结论,在 322 例样本中,SHOX2 和 RASSF1A 基因甲基化联合检测的灵敏度为 81.0%,特异度为 97.4%,显著优于单一基因甲基化检测。

纤维支气管镜较少应用于可疑周围型肺癌患者,并且具有一定的侵入性,这限制了支气管肺泡灌洗液的临床应用。但是对于可疑中央型肺癌患者而言,支气管肺泡灌洗液则为理想的检测样本。

4   痰液中抑癌基因甲基化联合检测与肺癌早期诊断

痰液是支气管肺泡灌洗液的首选替代样本,其容易通过非侵入性方法获取,简单方便,易被患者接受。且有研究表明痰液中基因甲基化水平与肿瘤组织的一致率达 78%[25]这提示痰液标本中基因甲基化检测有望成为理想的肺癌早期诊断。

Hubers 等[26]对 275 名健康受试者痰液中的 RASSF1A、3OST2 和 PRDM 14 基因甲基化进行检测,并对受试者进行随访,发现 3 种基因甲基化联合检测可以在临床诊断之前 2 年检出部分肺癌患者。肺癌组 RASSF1A、3OST2 和 PRDM 14 基因高甲基化阳性率分别为 17.2%、3.4%、6.9%,而 3 种基因组成的模板可以检测出 28% 的肺癌病例,且特异度为 90%。虽然灵敏度较低,但提示痰液基因甲基化联合检测具有能够在临床诊断之前识别无症状肺癌高危个体的潜力,这对肺癌早期诊断至关重要。此外 Hubers 等[27]对 72 例肺癌患者及 86 例非肿瘤患者痰液样本中的 RASSF1A、3OST2 和 PRDM14 三种基因进行甲基化检测,发现三种基因甲基化检测肺癌的灵敏度为 42.5%~60.3%,而联合检测可以检出 82.2% 的肺癌病例,显著优于单一基因甲基化检测。在另一项研究中,Hubers 等[28]前瞻性收集 697 例痰液标本,随机生成 2 个子集,并对其进行 RASSF1A、APC、CYGB 等 3 种基因甲基化检测。在集合 1 中,三种基因灵敏度为 31%~40%,特异度为 87%~96%,而联合分析可以将灵敏度提高至 63%,特异度为 78%。在集合 2 中也得到了相似的结论,三种基因联合检测可以检出 90% 的肺癌患者,并且显著优于痰液细胞学检测(灵敏度为 22%)。

然而痰液中细胞含量具有多变性,可能含有口腔上皮细胞,因此需要对患者进行适当培训,正确收集痰标本[29]。此外,对于非吸烟的患者来讲,痰液的收集相对困难,而诱导排痰在临床上较难实施。痰液样本量相对较小,所含 DNA 含量少,需要反复收集,且有研究表明,延长痰液收集时间可以显著提高痰液中甲基化联合检测的灵敏度[30]。因此就痰液收集过程中的相关难点需要进一步研究来提高痰标本在临床中的应用。

5   结语与展望

表观遗传学研究近年来蓬勃发展,尤其在肿瘤研究领域进展迅速。作为一种主要的表观遗传学修饰,DNA 甲基化在肺癌早期诊断中具有广阔的应用前景,并且多基因甲基化的联合检测较单一基因甲基化检测有更大的优势。但是,现有关于多基因甲基化联合检测的研究样本量相对较小,各研究之间数据差异较大,且基因少有重叠,因此需要大数据、多基因的多中心研究,来验证其在肺癌早期诊断中的价值,并筛选最优的基因组合。此外,无创样本的固有不足仍然需要检测技术的不断进步予以弥补,使其更好地应用于临床。非恶性肿瘤患者检出基因异常甲基化的问题仍然需要长期随访来了解其癌变的风险。抑癌基因甲基化与饮食、吸烟、环境、年龄等因素的关系仍然需要大规模流行病学研究来明确其相关性。总之,多基因甲基化联合检测在肺癌早期诊断中具有重要意义,具有广阔的临床应用前景。

利益冲突:无。

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关键词:
抑癌基因,甲基化,肺癌,痰液

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