文献精读 | 雄性大鼠背侧网状核内μ-受体信号通路的转换与吗啡诱发的痛觉过敏相关

阿片类药物在治疗中重度疼痛方面占有举足轻重的地位，然而长期应用阿片可诱发痛觉过敏，其形成机制未完全阐明。既往研究发现，下行疼痛易化系统与阿片类诱发的痛觉过敏密切相关，但阿片与该系统相互作用的具体机制仍不明确。阿片类是下行疼痛易化通路的关键调控物质，其作用可表现为两种方式：①阿片与μ-阿片受体结合使受体与抑制性G蛋白偶联，抑制痛觉信号传导，产生镇痛效应。②长期使用阿片后，μ-受体与激动性G蛋白偶联，活化下游的腺苷酸环化酶／cAMP通路，导致痛觉过敏。极低剂量的阿片受体拮抗剂可阻断兴奋性信号通路，增强镇痛，减少耐受，并逆转痛觉过敏现象。

背侧网状核是脑内下行疼痛易化系统的重要区域之一，它可通过与脊髓背角相互联系，形成反馈性环路，放大痛觉信号在脊髓内的传递。该区域的脊髓投射神经元或非脊髓投射神经元均表达μ-受体，通常给予阿片类药物后，这些受体可被激活产生镇痛作用。但长期给予吗啡时，背侧网状核内的μ-受体及其偶联的信号通路如何变化，产生何种效应，目前尚无相关研究。研究表明：在特定情况下，背侧网状核可受到阿片类药物调控，激活下行疼痛易化系统。作者由此提出研究假设：背侧网状核内μ-受体偶联信号通路的改变可能参与了阿片诱发的痛觉过敏形成。

作者通过皮下微泵持续注射建立吗啡诱发痛觉过敏的雄性大鼠模型，观察了背侧网状核内μ-受体mRNA（定量RT-PCR）及蛋白（免疫组化）的变化；分析了μ-受体偶联的兴奋性通路下游蛋白--磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（免疫组化）的变化。通过在背侧网状核使用特定药物（利多卡因，DAMGO，纳洛酮，H-89）干预μ-受体及其偶联的信号通路，并借助慢病毒下调μ-受体表达，观察模型动物痛觉过敏行为（Von Fray机械痛阈测定和热板测试）的变化。

以45ug·ul-1·h-1的速度持续输注吗啡建立大鼠模型，在开始输注前，输注5h，2天，4天和7天这5个时间点分别做行为学检测。观察到在给药5h后产生镇痛效应（Fig.1A-B），随后逐渐出现痛觉过敏，表现为对机械性刺激和热刺激的阈值降低。其中机械性超敏从第4天开始具有统计学差异（Fig.1A），温度性超敏在第7天时变得显著（Fig.1B）。

向背侧网状核内注射利多卡因可逆转机械性超敏（Fig.2A, 2C）和温度性超敏（Fig.2B, 2D）。而在目标区域外注射利多卡因仅表现为机械性刺激阈值的增加（Fig.S4A, S4B），并不能逆转痛觉过敏现象。为排除注射利多卡因对大鼠肢体运动的影响，同时进行了跑步机测试，背侧网状核注射利多卡因与生理盐水组相比未见明显差异（Fig.S5）。

通过定量RT-PCR比较背侧网状核内μ-受体mRNA的水平，吗啡组与生理盐水组未见显著差异（Fig.3D）。利用免疫组化分析背侧网状核内μ-受体阳性细胞，发现吗啡组(103 ± 26个细胞)明显多于生理盐水组(63 ± 9个细胞; Fig.3A–C)。

免疫组化分析背侧网状核内磷酸化cAMP反应元件结合蛋白阳性细胞核，发现吗啡组(1,329 ± 315个细胞核)高于生理盐水组(935 ± 218个细胞核;Fig.4A–C)。为明确该效应是否局限于背侧网状核内，作者对邻近区域内磷酸化cAMP反应元件结合蛋白阳性细胞核的分布情况也进行了分析，未见吗啡组与生理盐水组间显著差异（Fig.S6A-G）。

μ-受体的特异性激动剂DAMGO正常情况下可产生镇痛作用。在吗啡组的背侧网状核内注射DAMGO会加剧吗啡诱发的机械性超敏，但对温度性超敏反应似乎并无影响（Fig.5A-B）。在生理盐水组进行同样操作，大鼠则表现出对机械性和热刺激的敏感性下降（Fig.5C-D）。在目标区域外注射DAMGO则无明显作用（Fig.S4C-D）。

为明确μ-受体的表达是否参与了阿片诱发的痛觉过敏，作者利用慢病毒下调了大鼠背侧网状核内的μ-受体表达，以注射空载体作为对照。实验发现注射空载体的吗啡组与生理盐水组相比，μ-受体阳性细胞更多；注射μ-受体下调载体的吗啡组及生理盐水组中，μ-受体阳性细胞均有所减少（Fig.6A-C）。进一步的行为学检测发现，注射空载体的吗啡组大鼠机械刺激阈值降低，热板测试时间缩短，表现出机械超敏及温度超敏；而注射空载体的生理盐水组仅表现为机械性刺激的阈值降低（Fig.7A-B）。敲减μ-受体后，吗啡组的痛敏现象有所好转，而生理盐水组则出现了相反的效应（Fig.7C-D）。

吗啡组内比较，敲减μ-受体的大鼠机械性刺激阈值(−17 ± 8% vs.−40 ± 9%)和热板测试时间降低的幅度较空载体组更小(−10 ± 5% vs. −32 ± 2%)，表明敲减μ-受体能够改善阿片引起的痛觉过敏（Fig.7E-F）。而生理盐水组内比较，μ-受体敲减则显著降低了大鼠的机械性刺激阈值(31 ± 8% vs. −17 ± 8%)，缩短了热板测试时间 (−24 ± 6% vs. −2 ± 10%)，表现出更严重的感觉超敏（Fig.7E-F）。

在背侧网状核内注射超低剂量的μ-受体拮抗剂纳洛酮，可显著缓解吗啡组大鼠的感觉超敏现象（Fig.8A-B），而对于生理盐水组，注射纳洛酮不会对大鼠的行为学检测结果产生影响。非背侧网状核区内的纳洛酮注射也会减轻吗啡诱发的机械性和温度性超敏（Fig.S4E-F），作者认为这是由于纳洛酮可弥散至邻近区域所导致。

鉴于超低剂量纳洛酮对痛觉过敏的显著缓解作用，作者又进行了纳洛酮预处理后30分钟吗啡组动物对DAMGO注射反应的研究。将纳洛酮预处理组与单独注射DAMGO组进行对比，作者发现纳洛酮预处理可完全逆转DAMGO引起的感觉超敏（Fig.9A-B）。与前述实验结果相类似，非背侧网状核内的纳洛酮预处理也可产生镇痛效果（Fig.S4G-H）。对背侧网状核进行免疫组化检测分析发现，纳洛酮预处理(909 ± 77个细胞核)可明显减少磷酸化cAMP反应元件结合蛋白细胞核的数量(1,099 ± 163 细胞核;Fig.9C–E)。

为明确在阿片诱发的痛觉过敏中，背侧网状核内的蛋白激酶A信号通路是否参与其中，作者在背侧网状核内及邻近区域均注射了蛋白激酶A抑制剂H-89，检测其对吗啡组大鼠痛觉行为的影响。结果显示，与注射生理盐水相比，H-89不会影响大鼠的痛觉行为检测结果（Fig.10）。

本研究发现吗啡诱发痛觉过敏的大鼠模型中，背侧网状核内注射利多卡因使背侧网状核活动减弱，逆转阿片诱发的痛觉过敏现象。而在该区域内下调μ-受体表达，或使用超低剂量纳洛酮阻断兴奋性信号通路，可以预防和减轻阿片诱发的痛觉过敏。

文章明确了背侧网状核内μ-受体信号通路变化与阿片诱发痛觉过敏的相关性，并证实长时间输注吗啡会导致背侧网状核内μ-受体增加，使其偶联的信号通路由抑制性转向兴奋性，从而增强下行疼痛易化系统，引发痛觉过敏。

   
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