南方医科大学和广州中医药大学合作发现相互作用的小分子抑制剂

2020
08/25

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药物化学前沿
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免疫疗法已被广泛用于癌症的治疗。癌症免疫疗法旨在激发自身免疫系统来对抗肿瘤,是癌症疗法中发展最快的领域之一。其中,程序性细胞死亡-1/程序性细胞死亡-配体1(PD-1 / PD-L1)是免疫肿瘤学领域最有前景的靶标之一。

PD-1与B7家族的两个配体PDL1和PD-L2结合。研究表明,肿瘤微环境可以诱导浸润的T细胞过表达PD-1蛋白,而PD-L1(PD-1的配体)在肿瘤细胞中过表达。PD-1与其配体PD-L1的结合导致癌症患者T细胞功能的下调,从而抑制了抗肿瘤免疫能力并导致T细胞衰竭。PD-1/PD-L1抑制剂可阻断PD-1与PD-L1的结合,干扰负调控机制,并增强T细胞的活性,从而增强免疫反应。

PD-1/PD-L1抑制剂,也称为免疫检查点抑制剂,在各种类型的癌症中均有效。到目前为止,美国FDA已批准了六种用于癌症治疗的免疫检查点抑制剂,均为单克隆抗体,包括Ipilimumab(抗CTLA-4,百时美施贵宝),Pembrolizumab(抗PD-1,默克),Pembrolizumab(抗PD-1,百时美施贵宝),Duvalumab(抗PD-L1,阿斯利康),Atezolizumab(抗PD-L1,罗氏)和Avelumab(抗PD-L1,辉瑞和默克)。抗体介导的免疫检查点阻滞已在不同类型的肿瘤(例如恶性黑色素瘤,头颈部鳞状细胞癌和转移性非小细胞肺癌)中显示出临床效力。然而,治疗性抗体具有若干缺点,例如免疫原性,循环半衰期长,组织和肿瘤渗透性差,口服生物利用度低以及生产成本高。此外,当前可用的抗肿瘤单克隆抗体仅靶向细胞外受体/蛋白质(仅占癌症生物标志物的一小部分)。

与单克隆抗体相比,用于癌症免疫治疗的小分子PD-1 / PD-L1调节剂通常具有合理的药代动力学特性,包括更好的组织和肿瘤渗透性,更高的口服生物利用度,可接受的半衰期等。此外,可以口服给药提供了在治疗过程中改进临床剂量的可能性。因此,小分子的PD-1 / PD-L1调节剂有可能克服治疗性抗体的现有缺陷,并且还可以与抗体联合使用,发挥协同的抗癌作用。

三年来,已经发现了数十种小分子PD-1 / PD-L1抑制剂,其中大多数仍处于临床前研究阶段。迄今为止,已报告了三类非mAb小分子:

(1)作为直接竞争性PD-1 / PD-L1调节剂的肽(例如,Peptide-1)

(2)破坏PD-1 / PD-L1相互作用并诱导PD-L1二聚化的小分子(例如BMS-8,BMS-202,间苯二酚衍生物)

(3)作用方式未知的小分子(例如SA-49)。CA-170是第一个类药性PD-L1小分子抑制剂,目前正处于I期临床试验(NCT02812875,治疗晚期实体瘤和淋巴瘤)。最新的研究表明,CA-170和PD-L1之间没有直接结合。需要进一步研究CA-170的作用机理。

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尽管用于癌症免疫疗法的小分子PD-1/PD-L1抑制剂前景广阔,但设计小分子抑制剂仍然具有挑战性,因为PD-L1中的结合口袋是疏水的,平坦的,空间较大且没有深的结合口袋。

 基于对接的虚拟筛选和药物设计,南方医科大学和广州中医药大学合作设计,合成并评估了多种新型骨架(包括查尔酮,类黄酮和间苯二酚二苄基醚)的PD-1 / PD-L1的小分子抑制剂。其中,NP19表现出了杰出的体外活性(IC50 = 12.5 nM)和优良的体内抗肿瘤效力。

基于对接的虚拟筛选和药物设计

研究人员通过基于虚拟筛选的药物设计发现了几种靶向人PD-1 / PD-L1相互作用的苗头化合物(化合物库:Targetmol;软件:Schrodinger Suite)。其中,排名第一的化合物Bavachinin为黄酮类支架。

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对接显示,Bavachinin相对较好地嵌入了由二聚体PDL1形成的疏水腔体——黄酮骨架与ALA121和TYR56具有疏水相互作用。但Bavachinin缺乏与PD-L1的一些关键相互作用,如BMS-202与TYR56的π-π相互作用。

 根据对接结果,研究者保留了Bavachinin的黄酮骨架,并在黄酮骨架中引入2-甲基联苯以模拟BMS-202与TYR56残基形成的π-π相互作用。基于此,研究者将2-甲基联苯引入类黄酮主链并变化其他位置的取代基,设计制备了一系列新颖的黄酮和查耳酮衍生物。

查尔酮衍生物CET1-13的生化评价.

查尔酮化合物CET1-13使用HTRF分析法进行评估。其中CET3活性最佳。

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CET3及BMS-202的分子对接结果显示,查耳酮骨架很好地嵌入结合口袋,且联苯部分与TYR56呈现π-π相互作用。然而,与BMS-202相比,尾部基团与周围氨基酸的结合模式呈现显著差异(以红色圆圈突出显示)。

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黄酮衍生物HT1-13的生化评价.

系列化合物中,HT11体外活性最佳。

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HT11的分子对接结果显示。其很好地嵌入了由二聚体PD-L1形成的疏水腔,并且保留了与TYR56的关键相互作用。此外,黄酮骨架的吡喃酮部分与TYR56(来自PD-L1二聚体的另一条链)形成新的π-π相互作用。然而,黄酮骨架的羰基通过迫使周围的氨基酸残基翻转从而致使疏水口袋变大(C中用红色圆圈突出显示)。因此,在该区域中取代小环(例如5元环和4元环)可能将增加其活性。

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研究人员进一步分析BMS-202与二聚体PD-L1蛋白的相互作用。BMS-202位于PD-L1同型二聚体的核心,填充了一个较深的疏水性口袋,其横截面具有类似圆柱形的形状。结合模式表明甲氧基和尾基之间有很大的空间(在A中用红色圆圈突出显示),可以被适当的5元或6元环占据。这表明在此位置的环融合策略具有一定的可行性。因此,研究人员随后设计并合成了一系列基于萘的PD-1/PD-L1抑制剂(N1-N17)。

萘类衍生物N1-17的生化评价.

所有的萘类衍生物IC50值均大于10μM,表明萘骨架可能不是最佳设计。

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化合物N9的分子对接结果显示,N9的N-(2-氨乙基)乙酰胺尾基与Asp122和Lys124形成氢键相互作用。其中,N9的NH部分与ASP122的羟基形成氢键;而BMS-202的NH部分与ASP122的羟基和羰基部分形成两个氢键,这表明抑制剂的亲水性尾部所产生的氢键相互作用的方向会强烈影响抑制剂的结合亲和力。

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为了进一步优化活性。研究者首先进行了分子建模/对接,以探索最近报道BMS-1001和BMS-1166的结合模式。BMS-1166和BMS-1001的尾基与二聚体PD-L1蛋白具有强相互作用。同时,苄基氰化物部分的引入还通过与ARG125形成氢键来增强与PD-L1蛋白的相互作用。此外,图中的白色圆圈突出显示了尾部基团与二聚体PD-L1蛋白之间的较大空间,该空间可能被适当的环或链占据。基于这些考虑,研究人员设计了系列具有各种尾基的PD-1/PD-L1抑制剂(化合物NC和NP系列)。

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化合物NC1- 12的生化评价.

带有氨基酸、短链、四元环的NC1,NC5、NC6显示出最佳的抑制活性。该部分SAR表明,可以通过修饰尾部取代基来调节小分子抑制活性。因此随后研究者着重于修饰具有不同小环和氨基酸的尾基,还探索了引入2,3-二氢-1,4-苯并二氧杂基部分对于抑制活性是否重要。

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化合物NP1- 25的生化评价.

大多数NP化合物IC50值在纳摩尔范围(10-100 nM)。表明各种尾基,例如氨基酸、小环、氮杂环丁烷具有良好的耐受性。同时,2,3-二氢-1,4-苯并二氧杂基部分的引入对不同化合物的活性具有不同的影响。

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化合物NT1- 22的生化评价.

接下来,研究者通过使用各种杂环(化合物NT系列)取代联苯部分进行进一步的修饰,以研究联苯部分对活性是否重要。结果表明,大多数NT化合物都具有较高的抑制活性,IC50值在纳摩尔范围内。当用各种杂环(如吡啶和嘧啶)取代联苯部分的末端苯基时,抑制活性有所下降(IC50>100 nM),这表明疏水联苯对于高活性至关重要。

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SAR总结

结构修饰的位点主要集中在六个区域上。在区域1中,可以应用环融合策略,但是环的大小对结合亲和力有很大的影响。在区域2中,基于萘骨架设计了一系列化合物,但所有化合物的活性均急剧下降。然而,沈阳药科大学的研究人员发现了三唑并吡啶类衍生物具有相对较高的活性(例如,A22,IC50 = 92.3nM),表明其方向和稠合环的大小可能会影响结合亲和力。在区域3中,酰胺连接基不是优选的,而喹啉环可以保留其活性。在区域4中引入吡啶甲腈或苯甲氰可以显著提高抑制活性。在区域5中用喹喔啉基团取代末端苯基部分活性提高,表明疏水性联苯有利于抑制活性。在区域6中,将哌啶环引入尾部取代基活性下降,表明亲水性尾部取代基最适合与PD-L1结合。

44711598335238598 基于上述SAR,研究人员发现小的结构修饰可导致活性的急剧变化,表明小分子抑制剂与PD-L1蛋白质结合的精确性和复杂性。

NP19对IFN-γ产生的体外效力.

阻断PD-1 / PD-L1相互作用可以增强T细胞增殖和IFN-γ分泌。因此,研究人员使用肿瘤/T细胞共培养测定法评估NP19对IFN-γ产生的影响。结果表明,化合物NP19以剂量依赖性方式显着提高了IFN-γ的产生。在NP19 10μ浓度下,IFN-γ分泌增加了160%。

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NP19的体内PK

在SD大鼠中,NP19的口服半衰期较长,然而口服生物利用度较低,需要高剂量才能提供足够的药物浓度以实现抗肿瘤功效。

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NP19在B16-F10黑色素瘤模型中抗肿瘤功效

在B16-F10小鼠黑色素瘤模型中,通过灌胃给药三个剂量NP19(25, 50, 100mg/kg),其肿瘤抑制效果明显优于阳性对照,并且没有观察到严重的毒副作用。

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NP19在H22肝细胞癌模型中的抗肿瘤功效

在BALB/c小鼠的H22肝细胞癌模型中,腹腔注射NP19。其显示了明显的抗肿瘤活性,且没有观察到明显的体重减小。

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NP19显示减弱的体外抗小鼠PD-1/PD-L1活性

NP19对小鼠PD-1/PD-L1相互作用的抑制作用要弱得多。从人PD-1/PD-L1结合检测过渡到小鼠PD-1/PD-L1结合检测时,活性损失>80倍。但值得注意的是,NP19在两种不同的小鼠肿瘤模型中均显示出显著的体内抗肿瘤功效,同时,在体外具有较高的抗人PD-1 / PD-L1活性,这表明NP19在抑制人类肿瘤生长方面可能更有效。

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NP19通过激活小鼠免疫微环境抑制肿瘤生长

NP19在10μM的浓度下对人非小细胞肺癌细胞系A549、小鼠黑素瘤细胞系B16-F10三种细胞系没有显示明显的抑制作用,表明NP19没有直接的细胞毒性作用。

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临床研究表明,PD-L1的表达是使用PD-1/PD-L1抑制剂后治疗应答及结果的预测指标,PD-1 / PD-L1抑制剂的治疗效果与PD-L1表达之间存在正相关。与阴性对照组相比,mAb治疗组的PD-L1蛋白阳性率为16.2%。PD-L1蛋白的高表达水平与NP19在患有黑色素瘤的BALB/c小鼠中的高抗肿瘤功效密切相关。

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此外,肾脏和肝脏的H&E染色表明NP19对黑色素瘤小鼠的主要器官没有明显的毒副作用。黑色素瘤肿瘤组织的H&E染色还显示,在NP19治疗组中观察到大量的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)(红色箭头突出显示),表明已向活化的免疫微环境转变,而非转向免疫抑制微环境。

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此外,在经过NP19处理的三种黑色素瘤肿瘤组织中,25 mg / kg剂量下,辅助性T细胞的百分比高于阳性对照(P <0.05)。50 mg / kg或100 mg / kg NP19处理后,肿瘤组织中活化的细胞毒性T细胞百分比显着高于阳性对照(P <0.05)。

 在脾组织中,NP19治疗组和对照组中辅助性T细胞和活化的细胞毒性T细胞的百分比无显着差异。低剂量(例如25 mg / kg)的NP19可以激活辅助性T细胞,而高剂量(≥50mg/ kg)的NP19可以激活TIL中的细胞毒性T细胞。

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综上,NP19的抗肿瘤活性与肿瘤微环境的调节有关,并与肿瘤浸润淋巴细胞的数量增加有关。

总结

PD-1 / PD-L1单克隆抗体已经取得了巨大成功,但是小分子PD-1 / PD-L1抑制剂的开发仍处于起步阶段,因为迄今为止发现的大多数化合物仍处于临床前阶段。小分子PD-1 / PD-L1抑制剂可能具有与mAb不同的药代动力学和药效学特征,但是设计该类小分子仍颇具挑战,因为PD-1和PD-L1之间的界面是疏水、平坦且延伸的(约1.700Å)。疏水界面也可能导致假阳性结果。此外,小分子PD-L1抑制剂可能是疏水性分子,可能导致毒性及不良的药代动力学性质。

因此,发现新的PD-1 /PD-L1抑制剂的未来方向将集中在改善药代动力学特性和毒性方面。

参考文献

Binbin Cheng, etal. Discovery of Novel Resorcinol Dibenzyl Ethers Targeting the Programmed CellDeath-1/Programmed Cell Death–Ligand 1 Interaction as Potential AnticancerAgents. J. Med. Chem. 2020,63, 15, 8338–8358.

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关键词:
NP19,抑制剂,肿瘤

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