机械瓣膜置换术后稳定期华法林抗凝治疗质量评价及其基因学研究

任荣1，钱永军1，黄云2，李涛1，肖锡俊1

1. 四川大学华西医院 心脏大血管外科 国家老年疾病临床医学研究中心（成都  610041）

2. 自贡市第四人民医院 胸心外科（四川自贡  643000）

通信作者：肖锡俊

关键词：机械瓣膜置换；抗凝治疗质量；治疗范围时间；华法林敏感；华法林抵抗；基因；剂量预测

引用本文：任荣, 钱永军, 黄云, 李涛, 肖锡俊. 机械瓣膜置换术后稳定期华法林抗凝治疗质量评价及其基因学研究. 中国胸心血管外科临床杂志, 2019, 26(7): 681-687. doi: 10.7507/1007-4848.201809047

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摘要

目的 评价机械瓣膜置换手术后稳定期患者的华法林抗凝治疗质量，观察复方丹参片对机械瓣膜置换术后患者华法林抗凝治疗效果的影响，VKORC1、CYP2C9 及 CYP4F2 的基因多态性对机械瓣膜置换术患者术后稳定期华法林敏感及华法林抵抗的影响。方法 2011 年 7 月至 2014 年 2 月在门诊随访时登记我们所施行的机械瓣膜置换手术后≥6 个月的患者 1 831 例，记录患者基本临床资料。抗凝治疗采用目标国际标准化比值（INR，1.6～2.2）及以每周为单位的华法林剂量调整策略。筛选 46 例需加用复方丹参片的患者，记录服用复方丹参片前后 INR 检测值并比较其差异。将本研究纳入患者按华法林服用剂量的百分位数进行分组，即华法林敏感患者、对照患者、华法林抵抗患者，筛选其中 101 例患者，采用 TIANGEN Blood DNA Kit 血液基因组 DNA 提取试剂盒提取样本，以聚合酶链限制性片段-长度多态性分析法（PCR-RELP）测定患者基因型。检测的基因位点为：CYP4F2：rs2108622C>T 位点；VKORC1：1639G>A 位点；VKORC1：1173C>T 位点；CYP2C9*2：rs1799853C>T 位点；CYP2C9*3：1061A>C 位点。结果 （1）本研究观察期间内所纳入患者目标 INR 范围治疗范围时间（time in therapeutic range，TTR）和治疗范围时间分数（fraction of time in therapeutic range，FTTR）分别为 27.2%、49.4%，可接受 INR 范围内的 TTR 和 FTTR 分别为 34.2%、63.4%。（2）加用复方丹参片的患者在加用前及加用后，INR 检测值分别为 1.55±0.03、1.69±0.30，差异有统计学意义（P<0.05）。（3）基因检测患者共 101 例，其中 VKORC1：1173C>T 基因位点中 C/T 构成比在华法林敏感、对比及华法林抵抗患者中依次升高，而 CYP2C9*3：1061A>C 基因位点中 C/T 的等位基因位点构成比依次降低。CYP4F2 基因、VKORC1639 基因、CYP2C9*2 基因位点无差异。（4）国际华法林临床药理协会（IWPC） 模型预测服用华法林剂量仅与华法林敏感患者实际服用华法林剂量吻合。结论 机械瓣膜置换术后稳定期患者相对较低的 TTR 及 FTTR 是可以接受的。在合适的情况下，患者加用复方丹参片有益。VKORC1：1173C>T 位点及 CYP2C9*3：1061A>C 位点的突变是机械瓣膜置换术后稳定期华法林剂量敏感及华法林抵抗的主要药物基因学因素。

正文

华法林抗凝治疗效果评价的最佳方式是记录与抗凝治疗有关并发症的确切数量[1]，然而机械瓣膜置换手术 6 个月后患者的抗凝治疗有关并发症发生率相对较低，此时的抗凝相关并发症研究需要巨大的患者样本量[2-3]。因此目前国外多采用治疗范围时间（time in therapeutic range ，TTR）及治疗范围时间分数（fraction of time in therapeutic range，FTTR）评价华法林抗凝治疗的质量，但这些研究均存在着观察评估时间较短的问题[4-6]。本研究采用了 TTR 和 FTTR 评价我们所施行的机械瓣膜置换手术患者术后较长期的抗凝治疗质量。华法林抗凝治疗的安全范围窄，且其吸收及代谢受基因、食物、药物以及肝功能等多因素影响[7-8]。患者达到抗凝治疗要求所需的华法林剂量个体差异大[9-10]。复方丹参片是具有活血化淤的中成药。有研究显示它除本身能发挥抗凝作用外，还能增强华法林的抗凝效果，且作用平缓温和[11]。既往研究将抗凝治疗患者需服用明显较低华法林剂量的现象定义为华法林敏感（warfarin sensitivity）[12-13]，而服用明显较高华法林剂量的现象则定义为华法林抵抗（warfarin resistance）[14]。国内外研究显示多个基因位点的多态性影响患者华法林起始及维持剂量，包括 CYP4F2、VKORC1 和 CYP2C9，但结果不一致[15-17]。因此目前尚不十分清楚导致华法林敏感或华法林抵抗的基因学基础。

1   资料与方法

1.1   临床资料和分组

（1）在 2011 年 7 月至 2014 年 2 月共 32 个月的门诊随访期间连续登记了我们所施行的机械瓣膜置换手术后的 1 831 例患者。记录患者姓名、性别、年龄、身高、体重、手术日期、出院日期、手术方式、INR 监测值、INR 检测时间，门诊复查时每周的华法林服用剂量、门诊复查后要求的每周华法林服用剂量、是否存在与抗凝治疗有关的血栓形成、栓塞及出血情况。（2）本研究中患者国际标准化比值（international normalized ratio，INR）在可接受范围低限时采用华法林联合复方丹参片抗凝，并评估其疗效。纳入患者中筛选需加用复方丹参片患者共 46 例， INR 检测次数为 92 次，前后 2 次检测间隔时间为 2 个月。这些患者口服华法林剂量为 9.375～44.375 mg/周。（3）本研究患者按华法林服用剂量百分位数进行分组，将华法林服用剂量百分位数≤10% 的患者定义为华法林敏感（≤13.5 mg/周），即华法林低剂量组；将华法林服用剂量百分位数≥90% 的患者定义为华法林抵抗（≥31.25/周），即高剂量组；而将华法林服用剂量百分位数 45%～55% 的患者作为对照（17.5～23.75 mg/周），即中等剂量组。筛选其中 101 例患者进行基因检测。

1.2   方法

1.2.1   纳入及排除标准

纳入机械瓣膜置换术后稳定期（≥6 个月）患者。排除标准为：（1）观察期间内 2 次复查间隔时间≥6 个月的患者；（2）观察期内连续 2 次未按要求服用华法林患者；（3）基因检测中排除服用胺碘酮、巴比妥等影响华法林药物代谢动力学的患者，并排除服用阿司匹林、维生素 K 等影响 INR 检测值的患者。

1.2.2   华法林抗凝及复方丹参片治疗策略[18]

本研究采用的目标 INR 为 1.6～2.2，可接受的 INR 值为目标 INR±0.1。当患者 INR 检测值在目标 INR 范围（1.6～2.2）时，要求患者 3 个月再次复查。以每周为单位进行华法林剂量调整。对于二尖瓣、三尖瓣及双瓣膜置换手术及术前存在明显危险因素（左房血栓、巨大左房、心房颤动等）的患者当其 INR 检测值 ≥1.50 且<1.60 时要求每天加用复方丹参片（3 片，每日 1 次）。

1.2.3   患者华法林抗凝相关基因及方法

检测筛选患者的基因位点为 CYP4F2：rs2108622C>T 位点、VKORC1：1639G>A 位点、VKORC1：1173C>T 位点、CYP2C9*2：rs1799853C>T 位点、CYP2C9*3：1061A>C 位点。采用 TIANGEN Blood DNA Kit 血液基因组 DNA 提取试剂盒提取样本，以聚合酶链限制性片段-长度多态性分析法（PCR-RELP）测定患者基因型。

1.3   统计学分析

使用 SPSS 19.0 软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用 Fisher 确切概率法、卡方检验、成对样本差分 t 检验及 Wilcoxon 带符号秩检验进行样本统计。检验水准 α=0.05。

2   结果

1 831 例患者的临床资料见表 1。

2.1   手术类型

本研究纳入患者所接受的手术为：二尖瓣置换术 1 151 例（64.0%），二尖瓣及主动脉置换术 463 例（28.6%），主动脉瓣置换术 168 例（9.6%），二尖瓣及三尖瓣置换术 32 例（1.0%），三尖瓣置换术 25 例（0.8%），二尖瓣、主动脉瓣及三尖瓣置换术 9 例（0.5%），主动脉瓣及三尖瓣置换术 3 例（0.05%）。

2.2   本研究观察期纳入患者的抗凝治疗质量评价

本研究纳入患者目标 INR 范围内患者的 TTR 为 27.2%；而在可接受 INR 范围内的 TTR 为 34.2%；本研究纳入患者目标 FTTR 为 49.4%；在可接受 INR 范围内 FTTR 为 63.4%。

2.3   抗凝有关并发症与 ACCP 指南相关数据比较

本研究观察期内患者发生 Ⅲ 级血栓形成及栓塞并发症 4 例，其中脑梗塞 2 例，机械瓣瓣环血栓形成 1 例，眼底血栓 1 例；发生 Ⅲ 级出血并发症 5 例，其中脑溢血 3 例，严重消化道出血 1 例及子宫出血 1 例；另有皮肤黏膜、牙龈出血及鼻衄等Ⅰ级出血并发症 33 例 。

将本研究观察期内纳入患者的抗凝治疗有关并发症与 2012 ACCP 指南中的相关报道数据[19-20]进行比较；见表 2。

2.4   本研究纳入患者 TTR、FTTR 与前阶段研究纳入患者的 TTR 及 FTTR的对比

本研究统计所得 TTR、FTTR 与前阶段研究所得 TTR 及 FTTR 数值[18]进行比较，其中目标范围内 TTR 为目标范围内时间与总观测时间之比，本研究中的 TTR 值为 27.2%，前阶段研究中 TTR 值为 51.1%；而目标范围内 FTTR 为目标范围内 INR 检测次数与总的检测次数之比，本研究中的 FTTR 值为 49.3%，前阶段研究中 FTTR 值为 49.4%；见表 3。

2.5   复方丹参片对患者 INR 检测值的影响

加用复方丹参片前后 2 个月患者 INR 检测值中，首次 INR 检测值为 1.55 ±0.03，2 个月后 INR 检测值为 1.69±0.30，成对差分 t 检验 P 值为 0.002 及 Wilcoxon 带符号秩检验中双侧 P 值均为 0.002，加用复方丹参片患者在治疗前后 2 个月的 INR 检测值均数之间的差异有统计学意义。加用复方丹参片的患者 INR 检测值均数上升且未超过目标 INR 范围上限值。亦未发生 Ⅰ～Ⅲ 级与抗凝有关的出血并发症。

2.6   等位基因型位点分布及其 FTTR 均值

CYP2C9*2 基因中仅有两例患者为（C/T）基因型，其余患者均为（C/C）基因型；VKORC1639 基因则患者全为（A/A）基因型。这两种基因在低（38 例）、中（31 例）、高剂量组（32 例）患者中的分布均接近或达到 100.0%，各剂量组患者之间差异不明显。基因检测结果见表 4。华法林敏感组 FTTR 均值为 48%，对照组 FTTR 为 58%，华法林抵抗组 FTTR 为 49%，三组均数差异无统计学意义。

2.7   等位基因对华法林剂量影响结果

CYP4F2：rs2108622C>T 位点中 C 等位基因位点与 T 等位基因位点、VKORC1：1173C>T 位点中 C 等位基因位点与 T 等位基因位点、CYP2C9*3：1061A>C 位点中 A 等位基因位点与 C 等位基因位点构成比在华法林敏感、对照、华法林抵抗患者中具差异性，见表 5。其中 VKORC1：1173C>T 基因位点中 C/T 和 CYP2C9*3：1061A>C 基因位点中 A/C 的构成比在华法林敏感、对照、华法林抵抗患者的 OR 值及 95%CI 值（>1），差异均有统计学意义（P<0.05）；见图 1。上述现象提示 VKORC1：1173C>T 位点及 CYP2C9*3：1061A>C 位点的等位基因位点构成比差异导致华法林敏感、对照、华法林抵抗患者之间每周服用华法林剂量的明显差异。

2.8   华法林服用剂量与模型预测剂量的比较

比较华法林敏感（低剂量组）、对照（中剂量组）及抵抗患者（高剂量组）的实际服用华法林剂量与 IWPC 预测服用华法林剂量；见表 2。只有华法林敏感患者实际服用剂量与 IWPC 预测剂量的差异无统计学意义（P>0.05），余差异均有统计学意义，见表 6。

3   讨论

既往研究显示抗凝治疗有关并发症多出现在机械瓣膜置换手术后 6 个月以内，而机械瓣膜置换手术 6 个月后患者华法林抗凝治疗的有关并发症会明显下降，但是与抗凝治疗有关的并发症始终持续存在，并极大地影响这些患者的术后生活质量[21-24]。本研究进行了较长时间的观察（32 个月），纳入 1 831 例机械瓣膜置换术后稳定期（≥6 个月）的患者做为研究对象。本研究患者的 TTR 及 FTTR 低于国外相关报道[23, 25-26]，但抗凝治疗相关Ⅲ级血栓形成、栓塞及出血并发症发生率与国外相关报道的结果之间差异无统计学意义。这表明我们纳入的患者术后稳定期相对较低的 TTR 及 FTTR 是可以接受的。

国外有研究显示 TTR 和 FTTR 结果并不一致，TTR 较 FTTR 偏低[26]。2014 年我们在国内首先报告采用 TTR 和 FTTR 评价机械瓣膜置换术后患者华法林抗凝质量的初步观察，该研究显示 TTR 与 FTTR 的差异并不大[18]。而本研究观察期间内所纳入的患者 TTR 与 FTTR 的差异较大，在目标 INR 范围内和可接受 INR 范围内患者的 TTR 值均明显下降。比较这两次研究，注意到当前研究中术后达到 6 个月新纳入的患者达 389 例，而新纳入患者的 INR 检测次数多为一次。根据线性插值法原理[1]，单次 INR 检测结果无法用于 TTR 的计算，会使 TTR 计算时的有效数据大量损失，从而会造成统计差异。而 FTTR 可用于一个时间段内的抗凝质量评价的队列研究，也可以做特定时间点的横断面研究[26]，而通过横断面研究可以监测医疗单位的抗凝治疗质量并作出相应的改进。与 TTR 相比，FTTR 计算简便，患者 INR 值的信息量损失小，评价机械瓣膜置换术后患者华法林抗凝治疗质量更为可靠。

本研究也发现加用复方丹参片治疗 2 个月后患者的 INR 检测值由 1.55±0.03 增至 1.69±0.30（P<0.05），未观察到这些患者出现明显的出血及其它不适。既往在动物实验中已明确丹参可提高动物血浆 INR 值[27]，丹参本身具有抗血小板聚集作用[28]。在一项时间跨度为 34 年的系统回顾[29]，Chan 提出不应将丹参应用于华法林抗凝治疗的患者，以免增加这些患者出血的并发症。而我们在门诊随访中当患者 INR 检测值位于可接受 INR 范围下限时（1.5≤INR<1.6），且为二尖瓣、三尖瓣及双瓣膜置换术等高危因素时常规加用复方丹参片以增强华法林抗凝治疗效果，并未观察到明显的出血并发症。

本研究按华法林服用剂量百分位数分组定义华法林敏感及华法林抵抗，原因是达到抗凝治疗要求的华法林剂量随目标 INR 范围及患者种族的不一而有所不同[30]，按照目标患者人群的百分位数定义华法林敏感及及抵抗更为合理。华法林敏感患者所服用剂量容易超出实际所需剂量因而易引起出血并发症，反之华法林抵抗患者所服用剂量容易低于实际所需剂量则可导致血栓形成及栓塞。本组患者 2.5～61.2 mg/周的华法林范围清楚地显示了患者个体之间的巨大差异，且需华法林剂量最多的患者在术后经近 2 年的 INR 检测及华法林剂量调整方达到要求的目标 INR 值。本研究中也发现华法林敏感及华法林抵抗患者的 FTTR 较对照患者明显较低（48% vs. 49% vs. 58%），虽然差异无统计学意义，但据国外研究这样的差异足可导致华法林抗凝并发症发生率的明显变化[4-5,31]。

本研究检测了影响患者华法林口服剂量常见的 5 个基因位点，其中 VKORC1：1173C/T 是一个对华法林代谢有重要影响等位基因位点，在第 1173 碱基位置上发生了碱基 C 和 T 的互换，进而影响了华法林代谢[32-37]。本研究结果显示 VKORC1：1173C/T 位点碱基由 C→T 变异时，患者所需华法林剂量会增加。而患者 VKORC：1639G>A 基因全部为 A/A 基因型，既往研究也提示 VKORC1 -1639A/G 与 1173 C/T 呈现高度连锁不平衡[35]。因此在患者的华法林抗凝基因中检测 VKORC1 -1639A/G 基因位点意义不大。

CYP2C9 是华法林主要的代谢酶，CYP2C9 基因突变会导致 CYP2C9 酶活性的改变[36]。而在 CYP2C9 基因众多的多态性位点中，有两个多态性位点与华法林代谢密切相关：CYP2C9*2 和 CYP2C9*3。本研究中 CYP2C9*3：1061A>C 基因碱基由 A→C 变异时，个体所需华法林剂量增高。中国人 CYP2C9*2 基因变异少见，本研究中 CYP2C9*2 突变基因型的患者很少，研究纳入的 101 例患者中，只有 2 例为杂合子（C/T 型），其它均为野生型纯合子（C/C 型）。

Sagrieya 等[37]研究认为 CYP4F2 等位基因频率与华法林稳定剂量无相关性，也未发现 CYP4F2 等位基因频率与 TTR、华法林敏感、华法林抵抗有相关性。结合本研究中各组患者 CYP4F2 基因变异性并不明显，我们认为其对于临床预测患者华法林服用剂量的作用有限。

综上所述，本研究测定的各等位基因位点上，在华法林敏感患者中 VKORC1：1173C>T 位点的 C 等位基因低而 T 等位基因高，CYP2C9*3：1061A>C 位点的 A 等位基因频率高而 C 等位基因低；而华法林抵抗患者等位基因分布相反，VKORC1：1173C>T 位点的 C 等位基因高而 T 等位基因低，CYP2C9*3：1061A>C 位点的 A 等位基因低而 C 等位基因高；中剂量组的等位基因位点的分布频率则处于这两者之间，而且 3 组差异无统计学意义。而其他等位基因位点变异不明显。因此我们认为机械瓣膜置换术后稳定期患者抗凝相关基因检测中 VKORC1：1173C>T 位点及 CYP2C9*3：1061A>C 位点应是重点，当患者存在上述基因位点的变异时需适当缩短 INR 检测间隔时间及增加华法林调整的频率，以减少患者可能的血栓形成、栓塞及出血并发症。

国际华法林临床药理协会（IWPC）认为服用华法林前对患者进行基因检测，用药后总体住院率及出血或血栓并发症导致的住院率均会减少[38-39]。与 IWPC 华法林稳定剂量预测模型预测的剂量进行比较，结果显示：华法林敏感患者实际服用华法林剂量与 IWPC 模型预测剂量吻合，有明显相关性；而华法林抵抗及正常对照组患者则无这种相关性，实际华法林服用剂量与 IWPC 模型预测剂量相差太远，无明显相关性。该观察提示在我国应用 IWPC 模型预测华法林剂量对多数机械瓣膜置换术后稳定期患者并不可行。

总之，本研究表明：（1）机械瓣膜置换术后稳定期患者相对较低的 TTR 及 FTTR 是可以接受的。（2）FTTR 计算简便，系统误差小，因而 FTTR 做为抗凝治疗质量的评价指标更为可靠。（3）在适当的患者加用复方丹参片是有益的。（4） 华法林敏感患者基因学基础为 VKORC1 1173C>T 基因中 T 等位基因频率及 CYP2C9*3：1061A>C 基因中 A 等位基因频率升高；华法林抵抗患者基因学基础为 VKORC1 1173C>T 基因中 C 等位基因频率及 CYP2C9*3：1061A>C 基因中 C 等位基因频率升高。（5）IWPC 剂量预测模型仅与华法林敏感患者的实际服用剂量吻合。

利益冲突：无。