文献精读 | 皮质中间神经元功能异常介导感觉过敏

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背景

自闭症谱系障碍（autism spectrum disorders，ASD)是一组由多种神经发育性疾病组成的症候群。在ASD目前的诊断标准(DSM-5)中，感觉异常位列其中，包括对感觉输入的过度反应/敏感，然而其机制目前尚不清楚。人类功能性核磁共振成像（fMRI）和动物模型研究表明，皮质神经环路异常可能导致ASD患者对感觉输入反应异常，但缺乏直接的证据。

近年来，皮质GABA能中间神经元受到越来越多的关注，许多ASD动物模型中观察到中间神经元功能障碍。最近有研究发现，GAGB能神经元缺陷与ASD小鼠模型的多感觉整合障碍有关。然而，皮质GABA能神经元功能障碍与ASD感觉异常之间的直接因果关系尚未明确。

SHANK3基因家族编码突触后蛋白，在兴奋性突触的形成、树突棘发育和谷氨酸受体功能维持中发挥着重要作用。已有许多研究证明SHANK单基因突变即可导致ASD的发生。Shank3B敲除小鼠（Shank3B-/-）是目前研究ASD的重要动物模型之一。利用该模型，本文揭示了抑制性中间神经元功能在ASD感觉异常中的关键作用。

Step1   确认Shank3B-/-小鼠对感觉过敏

作者训练Shank3B-/-小鼠和对照组的野生型（WT）小鼠进行“触觉感知任务”。实验前限制小鼠摄入水，实验时固定小鼠头部，通过电压传感器刺激小鼠的胡须，对小鼠进行训练，使其每次感受到胡须被刺激时，舔舐出水口。刺激的强度由刺激的振幅决定。将hit与真实刺激次数的比值定为命中率，false positive与未刺激次数的比值定为假阳性率。用命中率和假阳性率的估计值，根据信号检测理论，计算每只小鼠的敏感指数d'。d'值越大，敏感性越高。此外对Shank3B-/-小鼠和WT小鼠的运动能力进行了测试和对比，排除实验组和对照组小鼠运动能力的差异。实验结果显示：对于强刺激，Shank3B-/-和WT小鼠的d'值无显著差异；而对于较弱的刺激，Shank3B-/-小鼠的d'值明显高于WT小鼠，即Shank3B-/-小鼠更敏感。为测量两种小鼠的感受阈值，构建心理测量曲线来呈现刺激幅度与命中率之间的关系。结果显示Shank3B-/-小鼠的感受阈值明显低于WT小鼠。这些结果表明，Shank3B-/-小鼠对外界刺激出现感觉过敏，这和ASD患者的临床症状非常相似。

Step2  Shank3B-/-小鼠皮层自发性以及

刺激引发的神经活动增加

为了研究感觉过敏现象的神经网络机制，对头部固定的清醒的Shank3B-/-小鼠和WT小鼠进行在体大规模双光子钙成像。使用兴奋特异性的人CaMKIIα启动子驱动钙指示剂GCaMP6f的表达。由于躯体感觉皮层对微弱刺激最为敏感，接近于感知阈值，结合第一部分行为学结果，故选择小鼠初级躯体感觉皮层（vS1）作为观察范围。结果显示，与WT小鼠相比，Shank3B-/-小鼠的兴奋性神经元自发活动增强，并且配对关联性增加。神经元关联性出现差异的原因之一是兴奋和抑制平衡的改变。在WT小鼠中，神经放电频率与关联性呈现线性关系；在Shank3B-/-小鼠中两者关系曲线更平坦。这些结果提示Shank3B-/-小鼠中神经元关联性的增加是神经环路的改变而不是单纯放电频率的改变。

随后对刺激引发的神经活动进行研究。刺激方式同第一部分。WT小鼠中在观察区域内对刺激产生反应的神经元占0.26±0.08，而Shank3B-/-小鼠中为0.52±0.11，不仅如此，反应强度也增加。以上结果均提示第II/III层的锥体神经元对外界刺激更为活跃和敏感。

Step3  Shank3B-/-小鼠抑制性体感皮层神经元活动减弱

既往研究发现，敲除Shank3基因会导致谷氨酸能突触传递能力降低，而本研究却观察到兴奋性神经元活性增高的现象。皮质神经环路兴奋/抑制平衡是维持正常功能的基础。在感觉皮层中，信息的传入和传出主要依赖兴奋性神经元，大脑由此感觉到外界刺激，而抑制性中间神经元则对兴奋性神经元具有重要的调控作用。最近有报道在Shank3B-/-小鼠的岛叶和vS1内发现PV中间神经元环路出现缺陷。因此作者提出假设：Shank3B-/-小鼠中兴奋性神经元过度活跃可能是由于抑制性中间神经元受损所致。显微注射AAV-Dlx5/6-GCaMP6从而选择性地对vS1的抑制性中间神经元进行双光子钙成像。结果显示，Shank3基因敲除小鼠的感觉皮层中抑制性中间神经元活动降低，而神经元之间的关联性在对照组和转基因组中均增加。

随后按照第二部分的研究方法，观察外界刺激引发的神经活动。发现在Shank3B-/-小鼠中外界刺激引发的神经元数量显著下降，并且电活动的幅度也降低。

Step4  特异性地敲除vS1区中间神经元的Shank3

造成中间神经元被抑制进而激活兴奋性神经元

锥体神经元高反应性是否是因为中间神经元Shank3缺失造成的？中间神经元活动的下调是否继发于神经环路发育异常？为了阐明这些问题，作者培育了由Dlx5/6启动子驱动Cre重组酶表达的条件性敲除鼠（Shank3Bfl/fl），特异性敲除vS1抑制性神经元中的Shank3，并使用单细胞PCR验证。结果证实所有中间神经元中shank3基因被敲除，而23.15±3.34%的兴奋性神经元中shank3被敲除。双光子钙成像结果显示，GABA能中间神经元缺失Shank3后，vS1的第II/III层中间神经元钙离子活动降低，神经元之间关联性增加。本文同时观察了抑制性神经元对外界刺激的反应性。结果显示，出现反应的抑制性神经元数量下降，反应的幅度也下降。这些结果证明敲除中间神经元中的Shank3会导致vS1的第II/III层中间神经元活性降低。

作者继续验证中间神经元活性降低是否会导致兴奋性神经元的兴奋性增加。在条件敲除vS1抑制性神经元中Shank3的同时，监测兴奋性神经元中GCaMP6的活性。条件敲除Shank3后，自发性钙活动增加，兴奋性神经元活性显著增强，并且神经元之间的关联性也增加了。对于外界刺激的反应也与Shank3B-/-小鼠中获得的结果相一致。

这些结果证实，敲除中间神经元的shank3后皮层抑制降低，皮层环路的兴奋性增加。

Step5  

特异性敲除中间神经元Shank3导致对外界刺激高反应

作者最后观察了行为学表现的改变：特异性敲除感觉皮层抑制性中间神经元Shank3是否足以引起小鼠触觉过敏。方法同第一部分，且与第一部分结果相似，敲除中间神经元Shank3的小鼠的感受阈值明显低于对照组小鼠。

由于在第四部分的研究中证实，敲除中间神经元Shank3的同时，约20%的兴奋性神经元中Shank3也被敲除，作者想了解散在和选择性的敲除shank3对放电率和行为学的影响。作者滴定注射携带重组酶的逆转录病毒，使40%的兴奋性神经元中的Shank3被敲除。结果显示兴奋性神经元中自发以及外界刺激引发的神经活动均下降，伴随行为学的改变。以上研究结果提示，在部分兴奋性神经元中敲除shank3B并不会改变对刺激的敏感性。

作者进一步观察单纯下调抑制性神经元活动是否足以解释在Shank3B−/−小鼠中观察到的现象。通过化学遗传学技术选择性降低感觉皮层局部中间神经元的活性，观察到了在Shank3B-/-和条件性敲除小鼠中同样的神经活动变化和行为学变化。这些结果证明vS1中间神经元Shank3缺失足以导致感觉超敏。

总结

感觉异常在ASD患者中普遍存在，给患者的日常生活带来了极大的困难。这项研究证实，大脑感觉皮层中间神经元Shank3基因缺失引起的中间神经元活性降低是导致ASD动物模型感觉过敏的关键机制，为寻找可能的ASD感觉异常治疗策略提供了重要的理论依据。

原始文献：

Chen Q, Deister CA, Gao X, Guo B, Lynn-Jones T, Chen N, Wells MF, Liu R, Goard MJ, Dimidschstein J et al: Dysfunction of cortical GABAergic neurons leads to sensory hyper-reactivity in a Shank3 mouse model of ASD. Nat Neurosci 2020, 23(4):520-532.

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米勒之声编辑部米勒之声