还在讲精准医疗的你,不知道单细胞测序就OUT了!

2020
07/21

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浩悦资本
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单细胞的独唱。

作者/策划:浩悦资本IVD与精准医疗行业组

本文原创自浩悦资本,转载或合作请在本文末尾处留言。

前言

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精准医学技术发展至今,已经在基因检测领域取得了一定建树:目前广泛使用的NGS(二代测序)技术能够灵敏、准确的发现人体组织、甚至血液中游离的DNA的突变结果,并对治疗进行指导。

但长期以来,针对人类基因组和疾病的研究都是基于“组织”或“血液”这样的整体概念,未能从单个细胞层面的基因表达,细胞行为的分辨率上进行分析。

细胞是生物体结构和功能的基本单位,长期以来,针对人类基因组和疾病的研究都是基于“组织”或“血液”这样的整体概念,未能从单个细胞层面的基因表达,细胞行为的分辨率上进行分析。目前我们熟悉的二代测序检测结果,仅能反映一群细胞中平均化的各类信号表达的中值或“主流”信息,单个细胞层面的“个体差异”信息则被忽视。对于肿瘤研究、神经疾病、免疫疾病等涉及细胞间异质性的疾病研究,从单细胞层面分析细胞基因表达,细胞间互作等是有重大意义的,因此能够解释单个细胞基因结构与表达状态,反应细胞间异质性的单细胞测序技术应运而生。

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一、单细胞测序技术的发展历史

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目前普遍认知中的“单细胞测序”技术其实比较“年轻”,最早起源于2008-2009年汤富酬教授的研究成果,汤富酬教授于2009年完成了世界首例单细胞RNA测序技术开发及试验。但在2015年之前,受限于现有单细胞分离技术,早期单细胞测序技术仅能检测少量细胞,且成本高昂。到了2015年,随着基于细胞条形码标记技术的高通量(或“海量”)单细胞分离与测序技术的成熟,科研人员有能力一次性对数千,甚至上万个单细胞进行标记和分析,使单细胞测序技术在临床上应用成为可能。

与此同时,单细胞技术在国内外成为了热门科研领域研究的技术手段新宠:

2013年,《Science》杂志将单细胞测序列为年度最值得关注的六大领域榜首,《Nature Methods》将该技术评为2013年度最重要的方法学进展。由于单细胞测序技术广阔的应用前景,2015年单细胞测序技术再度登上Science转化医学封面。2019年,单细胞测序被Nature期刊评为最值得期待的生物技术之一。仅2019年单细胞转录组测序相关的SCI论文就超过了1,500篇。在近10年对生物学的许多领域产生了深远影响。

2008年开始,NIH和NSF就对该领域持续进行投入,截止2019年NIH已投入接近16亿美元,期间启动的相关大型研究项目包括Human Cell Atlas及人类生物分子图谱计划等;国内的研究起步相对较晚:2017年,中国国家精准医学研究重点项目提出单细胞组学技术的开发及临床应用的重要性,并于2017年参与了“人类细胞图谱计划”;截止目前,国家自然科学基金在单细胞领域已经累计投入约4亿元人民币,用于技术开发和临床转化。

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从上图可以看出,2010-2014年之间,单细胞测序领域采用的主流技术的细胞通量都在100以内,2015年后,随着海量单细胞分离技术的出现,取得了高速的进步;进行单细胞测序前,首先需要分离单个的细胞,如何低成本的获得大量的单个细胞是单细胞测序流程中最重要的环节。2015年技术大爆发后,目前市场上比较成熟的单细胞分离方法主要是10X Genomics的Chromium(“液滴法”)及BD的Rhapsody(微孔法)平台。

二、单细胞测序技术原理概述(一般流程)

超高通量单细胞测序技术基本原理是利用微流控液滴系统或微孔板将分离的细胞与单个凝胶/聚合物微球,微球表面包裹有特异的寡核苷酸序列(细胞条形码)对同一细胞来源的mRNA分子进行标记,可以对数千个细胞的cDNA合并建库,省去了对单个细胞的重复操作,大大提升了单细胞测序的通量和单个细胞测序的成本。帮助研究人员得到带有独特分子标签的来自各个细胞的基因序列信息。

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如上图所示,单细胞测序服务的流程如下:

「组织样本获取 - 组织解离制备单细胞悬液 - 细胞分离与标记 - 细胞裂解与核酸捕获 - mRNA的反转录与扩增 - 建库&测序 - 生信分析 - 生成可视化报告」

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上述流程中,最为核心的环节是细胞的分离与标记,目前国际上两种最为主流的方法分别是液滴法(代表产品是10X Chromium)和微孔法(代表产品是BD Rhapsody)。

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如上图所示,10X Genomics和2015年Steven A等人提出的Drop-Seq具有类似的技术原理:从横向孔道中逐一输入微珠,第一纵向孔道输入细胞,凝胶微珠与细胞碰撞后会吸附在微珠上,并通过微流控技术,将之输入到第二纵向孔道,即油相孔道中。这时候,就形成了一个个油滴,最终输出并收集在EP管中。

每一个油滴中会落入一个细胞以及一个微珠,那么在每一个凝胶微珠中上长满了不同的Cell Barcode和UMI Barcode连接形成的序列,再加上一端PolyT(具有mRNA的PolyA结构)的抓手,构成我们的捕获凝胶微珠。而这个微珠抓手就会使用oligo dT抓住mRNA构建文库。

液滴法尽管2017年就由10x Genomics推出了商业化产品,且拥有通量高,成本低,捕获效率高的有点,但该方法对样本的细胞活性要求比较高,需要活性大于90%。而10x缺乏细胞保存运输的解决方案,因此经常需要上门服务;另外对于部分复杂组织样本,如肝脏、血液等,液滴法的处理效果可能会不尽如人意。

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BD公司于2015年8月,收购Cellular Research公司,从而推出了高通量单细胞转录组测序平台和数据分析平台BD Rhapsody™ Single-Cell Analysis System。BD采用最早于2015年推出的CytoSeq特有的蜂窝板技术。该技术用20W+的微孔(该数量级远大于Input细胞数量),基于泊松分布原理,将细胞悬液和带有标记的磁珠添加至每个微孔中,并保证单孔中的单细胞捕获。同时避免了10X中存在的概率碰撞影响捕获效率的问题,采用微孔捕获相对会有更好的捕获效率,保证Input细胞的全面使用。对于Input细胞的量更少的情况,可以基于十万级的细胞总量开始进行前期处理以及后期捕获操作。

如上图所示,该体系采用聚合物刚性Beads,捕获后在低温条件下可以保存3个月。Beads 上的序列结构与10X Genomics相似,可以捕获到游离mRNA的polyA尾。同时,该系统具有成像系统,在细胞捕获后,即可直观的看到细胞捕获数、细胞状态等信息。优点是可以实现多样本混合捕获;可以实现转录组-蛋白组联合分析。微孔法还有一个优势,就是更适合于RNA测序,对于转录组和蛋白质的观察效果比较好。

除了分离和标记,前处理、扩增、转录等环节也对用户体验,服务效率和最终的测序结果质量有着重要影响。各平台在这些方面的表现更多取决于企业的临床经验与服务能力:有能力提供高性能组织解离液、裂解与转录试剂、以及扩增和建库试剂,并提供配套自动化平台设备的企业,能够实现更高的样本处理效率和更优秀的用户体验。

经过上述一系列流程,决定分析结果质量的,是最后的生物信息处理环节。目前大多数企业的服务内容仅限于提供设备、试剂,或基础的数据分析服务,用户需要自行查阅文献和公共数据库对原始测序数据进行标注分析,导致解读结果缺少统一性和标准性;因此能够将自有数据库、公共数据库结合起来,对原始测序数据进行精准分析和可视化处理的企业,往往能够拥有更大的临床应用潜力。

三、单细胞测序技术应用领域与行业规模预测

1、科研方面

细胞是人体内最小的功能单位,单个细胞基因表达与功能的异质性决定发育中的细胞命运,同时也可能影响致病机理。单细胞测序技术通过对单个细胞的基因组/转录组/表观遗传组的检测,可以前所未有的分辨率揭示个体的发育及功能机制并且以前所未有的灵敏度检测和监控疾病。

下图揭示了为什么单细胞测序技术相比于传统的组织/细胞整体测序得出平均值的测序技术(Bulk Sequencing)能够得到更加准确的信息并且可以分辨出和疾病机理相关的细胞亚群。

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在科研方面,单细胞组学已经被用于研究机体各个器官和组织的发育和疾病机理,干细胞研究,肿瘤发病机理研究,生殖健康等。从2015年起被发明的各类海量单细胞测序技术(Massively Parallel Single Cell Sequencing)不仅可以精确分辨正常或者肿瘤组织中各类细胞亚群,同时可以对每一个细胞亚群的基因表达水平进行全面而深度的分析,揭示细胞亚群间的互作关系及特定细胞亚群在发育或者疾病中的功能。

此种一次可以将大量细胞分离成单细胞并给每个单细胞加上分子标签后联合扩增建库测序的海量单细胞测序技术,已经逐渐成为单细胞测序主流,被应用于血液病、肿瘤细胞异质性、鉴定罕见细胞类型、免疫细胞分型、疾病分型等领域的研究。见下图单细胞测序的文献统计:

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单细胞组学,特别是海量单细胞测序技术,可以将分子和细胞学检测方法的完美融合,在临床检验中可以同时给出细胞分型和定量,以及每个细胞亚群以致单个细胞的深层的基因或表达谱信息,有着现有分子或者细胞检测技术不能达到的全方位的高分辨率,可以给出与精准医疗更加直接相关的信息。新格元技术已经在和多个合作方的的肿瘤相关合作项目中成功地揭示了肿瘤内部异质性及可能的临床表型相关性,预示了海量单细胞测序技术在精准肿瘤检测中的广阔应用前景。

2、临床市场

肿瘤研究:肿瘤细胞的突变速率非常快,而且肿瘤组织是一种高度异质性的组织。确定肿瘤组织中存在哪些细胞亚群(或者叫克隆)具备转移能力,哪些克隆对化疗药物是敏感的,这些信息对于临床工作非常有帮助。结合近年来的研究进展,可以看到单细胞测序对于肿瘤免疫治疗等新手段可以提供巨大帮助,比如发现/确认新靶点等。新格元与上海肺科医院等单位联合开展的中国人群肺腺癌、鳞癌免疫基因组计划致力于考察肺癌肿瘤微环境中不同类型细胞的组分和特征,以及单细胞表达谱和疗效关系。

自体免疫疾病:人体内的免疫细胞为了实现不同功能,具有极强的杂合性,单细胞测序能在测定每一类细胞的基因表达的同时,对这些细胞进行区分,甚至进行更准确的亚型分类,为免疫学研究和相关疾病的治疗提供帮助。

神经生物学:单细胞测序能够比较好的研究单个细胞的表达谱,对神经细胞进行种类细分,并对细胞间的通信提供更多的信息,从而解开神经信号传递的秘密,为疾病治疗提供更多的思路。

发育研究:人体内的各类组织器官的发育都会受到细胞微环境的影响,不同个体的细胞发育命运各不相同。单细胞测序可以帮助我们对发育过程中的每个细胞个体的基因表达、作用以及细胞间的通信和影响进行解释。

3、行业规模预测

作为突破性的新技术,单细胞分析技术有望逐渐取代传统的整体样本二代测序,全球潜在科研市场体量已经达到130亿美元。单细胞测序技术的细分市场更是以年平均20%以上的速度逐年增长。在临床和药物开发方面的应用方面的市场潜力更是不可限量,可以代替或补充部分细胞和组织病理市场现有技术(市场体量:超过90亿美金,年增长13.5%),也可以用于新兴的细胞治疗,免疫治疗,基因治疗等生物药的开发和伴随诊断。

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根据Transparency Market Research预测,单细胞分析市场2017年已达到20亿美元,2025年预期超过60亿美元。

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4、主要驱动力

  • 科研,转化医学和临床应用的需求;

  • 测序成本的进一步降低;

  • 新技术新产品降低单细胞测序技术难度;

  • 数据存储分析能力的持续增强;

  • 单细胞组学与健康疾病关系的知识积累;

  • 单细胞测序市场内部由低通量技术向高通量技术的持续转化;

  • 海量单细胞测序并有望部分取代常规Bulk RNAseq及表观遗传测序(Bulk RNAseq市场在2017年已达到10亿美元,,CAGR 20.2%);

  • 临床应用上,海量单细胞测序有望取代部分组织细胞学病理检测(2017市场:约90亿美元,CAGR 13.5%)和常规血检。

四、代表企业介绍(10x VS 新格元)

任何新兴检测分析技术,一如当年的NGS,其真正价值最终都要在临床领域得到检验,而对于单细胞测序企业,浩悦资本认为主要的评价指标包括以下几个维度:

1、核心技术,包括单细胞的分离与标记等技术实力;

2、全流程服务覆盖能力;

3、生信分析与数据库建设能力;

4、与临床实践的结合能力。

接下来我们就从技术和应用等几个方面分析一下当前市场中的几家国内外代表性企业。

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10X Genomics成立于2012年,基于其核心产品Chromium系统,提供一系列单细胞测序和分析服务;2015年,公司推出全球首款基于液滴法的成熟单细胞测序产品。

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2019年9月,公司在NASDAQ上市,募资3.5亿美元,目前市值超过90亿美元;成立以来,公司累计融资超过2.4亿美元,股东包括Fidelity、富国银行、软银、Venrock等;并收购了专注于表观遗传学的Epinomics和二维基因表达技术开发商Spatial Transcriptomics。

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Chromium是10x的主要单细胞测序产品,硬件平台包括Chromium Controller和自动化升级版本Connect,配套的试剂盒以及生信分析系统Cell Ranger和配套的可视化软件Loupe Browser。

10x Genomics 2019年实现营收2.46亿美元,其中98%来自仪器和试剂销售,目前全球总装机量1,600余台。

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新格元于2018年在南京成立,是国内单细胞测序领域的代表企业;创始人方南博士曾任QIAGEN全球研发总监,拥有丰富的试剂开发经验。企业现有160余人,55%为硕博学历。

公司开发出了拥有自主知识产权的单细胞技术平台,是国内唯一有能力提供从组织到单细胞数据解析的完整解决方案的企业。

同时,新格元是业内率先与药企合作,正式将单细胞测序和三期临床试验结合,致力于将单细胞测序技术应用于临床诊断,开拓庞大的潜在市场。

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立足于拥有自主知识产权的微孔法单细胞分离平台,新格元开发出了覆盖组织解离 – 建库上机的全流程解决方案与配套的试剂和芯片,并于2020年6月推出了自动化单细胞系统平台 - Singleron Matrix™;目前已经累积了超过千万个的单细胞转录组数据,建立了业内最大的单细胞数据库,其中包括700+肺癌样本,能够为用户提供从样本寄送到可视化报告的一站式解决方案。

同时,新格元已经与包括君实、复星凯特、上海肺科医院在内的药企与临床用户广泛开展了针对肿瘤免疫/细胞疗法和肺癌细胞图谱等方面的临床合作,共同探索单细胞测序技术在肿瘤免疫伴随诊断和疾病机理研究中的广泛应用前景。

浩悦资本认为,无论是10X这样更偏向于“仪器销售”的企业,还是新格元这种通过服务推动产品IVD化的思路,核心技术、与临床的结合以及服务能力,都是至关重要的;作为一种新兴的技术,单细胞测序企业需要对潜在用户,尤其是国内用户进行足够的市场教育进行“培养”,才能掌握宝贵的临床数据、用户诉求,并打造出真正贴近市场需要的产品和服务。随着技术的进步,单细胞测序也将经历与NGS类似的成本降低 - 临床应用不断拓展的发展过程。如果你也关注精准医疗的现在与未来,单细胞测序,将是你不能错过的话题。

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关键词:
测序,组织,单细胞

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