新冠病毒保存液不能灭活病毒，谁来保证检验人安全？

当前市面上新冠病毒采集管保存和灭活效果不一，亟需建立国家强制标准才能保证灭活彻底和核酸稳定，切实降低假阴性！       当前，新型冠状病毒防控形势仍然十分严峻，作为核酸检测的第一步，样本采集与保存的重要性毋庸置疑，检验业内常说“garbage in, garbage out（垃圾标本出垃圾结果）”，最重要的影响因素首先是样品采集。如果样本采集出了问题，那么后面的各项工作做得再好，其结果也是无效的。目前国内有数百家病毒采集管厂商，很多都宣称“非胍盐”“灭活”保存液，它们的实际效果如何？真正能达到灭活病毒吗？能真正保存病毒RNA不降解吗？    

禽类冠状病毒鸡传染性支气管炎病毒(IBV)属于冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirinae)成员。该病毒具有多形性，呈现圆形，大小约为80-120 nm。病毒有囊膜，表面有杆状纤突，形似冠状。因为禽类冠状病毒与新型冠状病毒(SARS-CoV-2)同属于冠状病毒，只能感染鸡不能感染人，是一种极好的研究新冠病毒保存液各项参数的替代研究对象。本研究在严格实验室管理规范操作下，用禽类冠状病毒来探究不同新冠病毒保存液对鸡传染性支气管炎病毒灭活效果的影响，使用不同病毒保存液处理传支病毒，并对保存后的传支病毒样品进行灭活检验。

一  不同病毒保存液对禽类冠状病毒灭活效果的研究  

A、实验材料：SPF鸡胚购自济南斯帕法斯，并自行孵化至10日龄。鸡传染性支气管炎病毒采用 IBV QXL87株种毒。实验所用稀释液：生理盐水（0.9% NaCl）高压灭菌，并保存于4℃冰箱。

B、实验对象：1号保存液（康为世纪灭活保存液）、2号保存液（国家指导的非灭活型病毒保存液）、3号保存液（A公司灭活保存液）、4号保存液（康为世纪非灭活型病毒保存液）。

C、实验内容：分为两部分

1.1．不同病毒保存液灭活效果的鸡胚感染比较

将制备好的鸡传染性支气管炎病毒 QXL87株种毒添加至保存液中，按1（病毒原液）:10（保存液） 比例，置室温18-26℃灭活45min；将灭活好的病毒液接种SPF鸡胚进行灭活检验，同时对收获尿囊液进行鸡传染性支气管炎病毒核酸检测，参照GB/T 23197-2008 鸡传染性支气管炎诊断技术，使用康为世纪RNA提取试剂盒（货号：CWY070）提取RNA，并使用禽源冠状病毒核酸检测试剂盒(PCR荧光探针法)（货号：CW3120）检测。具体见下表。

1.2不同病毒保存液灭活效果的验证研究

根据1.1研究结果，选择合适的病毒保存液对病毒进行灭活，按兽药典要求进行灭活检验。将灭活好样品按尿囊腔接种方式接种10日龄SPF鸡胚，每个样品接种10枚鸡胚，0.1 mL/枚，置于37℃培养箱中培养144 h，弃去24 h死亡的鸡胚，观察记录24-144 h鸡胚死亡情况和接种后有病变的活胚数的数量。观察鸡胚病变，同时收获尿囊液进行PCR检测，即为第一代接种核酸检测结果。然后将第一次收获的四个尿囊液进行二次鸡胚接种，培养144h后收获尿囊液进行PCR检测，即为第二代接种核酸检测结果。

D、实验结果和讨论

图注：No1：康为世纪灭活保存液；No2：国家指导的非灭活型病毒保存液；No3：A公司灭活保存液；No4：康为世纪非灭活型病毒保存液

第一代收获的尿囊液进行IBV核酸检测。结果发现康为世纪灭活型病毒保存液对病毒消杀非常彻底，几乎检测不到。

图注：No2-1：康为世纪灭活保存液；No2-2：国家指导的非灭活型病毒保存液；No2-3：A公司灭活保存液；No2-4：康为世纪非灭活型病毒保存液

将第一代处理后含病毒样本进行盲传，检测第二代收获的尿囊液的IBV核酸水平，结果发现只有康为灭活型病毒保存液盲传一代能完全抑制病毒的繁殖。

二  灭活保存液对RNA保护能力的比较分析  

当前市场上的病毒保存液几乎都是直接保存活病毒，导致采样、运输和检测中的医护人员均面临较高的感染风险，针对这种情况，抗疫一线非常需要能直接灭活病毒的样本保存液，这样可以大大提高样本采集、运输过程中的安全性。但应该注意的是：在灭活病毒的同时，保存液还应考虑能否稳定保存病毒核酸的完整性，避免样本中的核酸在检测前降解，造成核酸检测“假阴性”。

我们对比了市面上含盐酸胍成分、含异硫氰酸胍成分的保存液和不含胍盐成分的保存液在37℃条件下保存禽类冠状病毒的效果。结果发现主要成分是胍盐的保存液，保存效果非常不理想！

同样都是37℃的条件，保存1-7天后，使用康为世纪保存液，病毒核酸保存效率基本恒定在100%；而使用其他两种胍盐成分保存液，病毒核酸的保存效率逐渐降低，到第7天的时候，已经低于20%，说明RNA随着时间推移正在剧烈降解！

结论：胍盐（异硫氰酸胍或盐酸胍等）作为一种经典的蛋白变性剂，常用于核酸提取中的细胞裂解，也可以达到灭活病毒的效果，但胍盐成分不具备在常温条件下保存病毒核酸的能力，极易造成样本降解，因此不适合用于新冠病毒样本的保存，所以强烈建议您选择非胍盐成分的病毒保存液。

在此，我们呼吁广大医疗工作者，如果您的采样目的是进行核酸检测，而且不需要培养活病毒，那么在选择病毒保存液时，需要注意以下几个方面：

1   采用可以灭活的病毒保存液

当前核酸检测是对样本中的病毒RNA进行检测，需要将病毒裂解，所以只要能保证病毒核酸的完整和稳定就可以了，不需要保存活病毒。因此，在当前抗击新冠病毒疫情的形势下，在样本采集的同时对病毒进行灭活，是更为理想的选择。市场上也有部分厂家推出了灭活型的保存液，但所用的灭活成分是胍盐，对比实验结果发现胍盐成分保存液不具备在常温条件下保存病毒核酸的能力，极易造成样本降解，因此不适合用于新冠病毒样本的保存，因此，我们推荐含有非胍盐的蛋白变性剂成分的病毒保存液，可以灭活病毒并保证病毒核酸在常温保存不降解。

2   采样管中的保存液体积要适宜

选择体积适宜的保存液非常重要：

①若每个样本单独采样，建议您选用1ml保存液的病毒采样管，不仅采样量能满足下游核酸提取检测需求，且相比3ml的保存液，其病毒的浓度提高了3倍！

②若进行较大规模初筛混检，3-4人的拭子样本放在同一采样管中，建议您选用3ml保存液的病毒采样管，使样本量能满足下游核酸提取需求，同时提高检测效率，降低检测成本。

3   采用可以常温运输保存样本的病毒保存液

因为RNA具有不稳定性，传统病毒采样管需要在4℃条件下48小时内运送至实验室，如果运输温度如果不达标，可能会造成病毒核酸降解，导致检测结果“假阴性”！相比之下，若采用可以常温运输并稳定保存病毒核酸的病毒保存液，则可以解决样本运输的难题，从而提高检测结果的准确性。

4   采用可保护样本免受高温灭活影响的病毒保存液

国家卫健委相关指南要求在提取病毒核酸前需要对样本进行高温灭活（56℃以上处理30min），但北京疾病预防控制中心、北京市预防医学研究中心等机构在Clinical Chemistry刊发的论文研究显示高温灭活会导致病毒核酸降解，从而降低病毒核酸的检出率，是导致新冠病毒核酸检出假阴性率过高的原因之一。采用康为病毒保存液保存禽类冠状病毒，稀释5个梯度进行提取和检测，比较高温灭活处理对核酸完整性的影响。结果表明，康为世纪病毒保存液可保护样本免受高温灭活影响。

我们进行了大量比对实验，各项实验结果都表明：

1）市面上所谓灭活保存液并不能灭活病毒；

2）很多保存液并不能让病毒RNA稳定存在。

如果将这些标榜能灭活病毒的非灭活保存液流到市场使用，将会给广大医务前线工作者带来极大隐患，让我们抗疫斗争功亏一篑。因此，我们呼吁国家尽快建立新冠病毒采集管技术标准！

编辑：Bling  

审校：Rose