肺癌术前新辅助免疫治疗单细胞测序取样操作流程

肺癌免疫治疗耐药后单细胞测序取样操作流程

穿刺样本采集、运输及接收标准

一、样本采集 1）采样前准备：a) 确认组织保存管完整、无裂痕且内含组织保存液。b) 组织保存液置于4℃条件下提前预冷30min。2 ) 取样：用粗针穿刺采集3条样本。    

注意事项：a) 不能用真空针采样。b) 如果条件允许，可以采集5条。c)穿刺样本的成功率低，司内为87%   d)通过增加穿刺样本数可以提高成功率，但是不能保证增加穿刺样本数就一定能成功。3) 处理组织：取好目标组织后，将目标组织用无菌PBS(或无菌生理盐水)清洗2遍，并立即将组织放入预冷的组织保存液中。（如果是含酶量比较高的组织，用PBS 或无菌生理盐水清洗2~3遍后用组织保存液清洗一遍，立即放入预冷的组织保存液中）。   

注意：同一穿刺部位的组织可置于同一管组织保存液中。4) 标记样本：用marker在组织保存管上标记样本编号（字母、数字或下划线，不超过8位，首位是字母，下划线位于中间, 例如A2019_01），标记要清晰、准确、完整、可识别。 5) 将样本置于4℃冰箱暂存。 

二、样本运输 1) 准备好冰袋、发泡膜和运输泡沫盒，请根据运输时间确认冰袋的数量，确保样本运输到达目的地时，样本温度仍在2-8℃，避免样本管直接接触冷冻冰袋，导致局部温度过低，细胞冻融、破裂。2）从冰箱中取出样品管并用封口膜封口，把样本和填写好的《单细胞测序样本信息单》装入封装袋并密封。3) 用发泡膜包裹装有样本的封装袋并用胶带密封，在准备好的运输箱中用常温冰袋将发泡膜包裹着的样本与冷冻冰袋隔开，用胶带密封运输箱。

三、收样标准

样本接收核查点及样本要求：1.完整性：组织保存管无破损、液体洒落。2.暂存及运输温度：2-8℃条件下暂存及运输。3.时效性：样本离体后不超过72h。4.标记：标记清晰、准确完整，可识别。5.样本质量：a)穿刺针针管外径≥1.2mm。b)每个样本穿刺条数≥3条。c)组织无结冰。

外周血样本采集、运输及接收标准

一、样本采集 1）取样：用EDTA管采集外周血5ml，取样完成后需要立即轻柔上下颠倒采血管4-6次。

注意：

a) 取样前需要确认EDTA抗凝管在保质期范围内。

b) 只能用EDTA抗凝管(客户自备)，不能使用其他类型的抗凝管。

c) 可以提供PBMC分离。

2 )标记样本：用marker在采血管上标记样本编号（字母、数字或下划线，不超过8位，首位是字母，下划线位于中间, 例如A2019_01），标记要清晰、准确、完整、可识别。 

3）将EDTA采血管置于4℃冰箱暂存。 

二、样本运输 同组织样本运输方法。

三、收样标准

样本接收核查点及样本要求：1.完整性：采血管无破损、液体洒落。无破损、液体洒落。2.暂存及运输温度：2-8℃条件下暂存及运输。3.时效性：a) 血液离体后不超过72h; b) EDTA采血管没有过期。4.标记：标记清晰、准确完整，可识别。5.样本质量： 全血体积≥5ml，样本无严重溶血、凝块。

PBMC样本采集、运输及接收标准

一、样本采集 1）免疫治疗耐药后患者PBMC，用无菌PBS清洗1-2遍，去上清后将细胞置于自备的细胞冻存液中。 2）标记样本：用marker在细胞冻存管上标记样本编号（字母、数字或下划线，不超过8位，首位是字母，下划线位于中间, 例如A2019_01），标记要清晰、准确、完整、可识别。3）样本暂存：按照一般细胞冻存的要求冻存细胞。 

二、样本运输 用细胞冻存液冻存的细胞，需要干冰运输。

三、收样标准

样本接收核查点及样本要求：1.完整性：样本管无破损、液体洒落。2运输及时效性：干冰运输，并于3自然日内运输到公司。自然日内运输到公司。自然日内运输到单细胞测序公司。3.标记：标记清晰、准确完整，可识别。4.样本质量：a) 细胞活性≥90%。b) 细胞数量>1×105。c) 细胞体积500μl-1ml。

组织样本采集、运输及接收标准

一、样本采集 1）采样前准备：a)确认组织保存管完整、无裂痕且内含组织保存液。b) 组织保存液置于4℃条件下提前预冷30min。 2 ) 取样： 手术切割下来组织后，立即于无菌条件下取目标组织。    

注意事项：   

a) 取样时用无菌手术刀或剪刀进行取样。电刀会引起目标组织灼伤，因此应避免使用电刀取样。   

b) 取样组织不能有坏死。   

c)不能取靠近电刀灼烧部位的组织。   

d)取样组织上不能有血凝块。 

3) 处理组织：取好目标组织后，将目标组织切成5×5×5mm3大小（100mg左右）的小块，用无菌PBS(或无菌生理盐水)清洗2遍，并立即放入预冷的组织保存液中。（如果是含酶量比较高的组织，用PBS 或无菌生理盐水清洗2-3遍后用组织保存液清洗一遍，立即放入预冷的组织保存液中）。   

注意：    

a)每管组织保存液只能放一份组织（5×5×5mm3大小）。

b)提供把组织样本制备成细胞悬液。

4)标记样本：用marker在组织保存管上标记样本编号（字母、数字或下划线，不超过8位，首位是字母，下划线位于中间, 例如A2019_01），标记要清晰、准确、完整、可识别。5) 将样本置于4℃冰箱暂存。 

二、样本运输 1) 准备好冰袋、发泡膜和运输泡沫盒，请根据运输时间确认冰袋的数量，确保样本运输到达目的地时，样本温度仍在2-8℃，避免样本管直接接触冷冻冰袋，导致局部温度过低，细胞冻融、破裂。2）从冰箱中取出样品管并用封口膜封口，把样本和填写好的《单细胞测序样本信息单》装入封装袋并密封。3) 用发泡膜包裹装有样本的封装袋并用胶带密封，在准备好的运输箱中用常温冰袋将发泡膜包裹着的样本与冷冻冰袋隔开，用胶带密封运输箱。

三、收样标准

样本接收核查点及样本要求：1.完整性：组织保存管无破损、液体洒落。2.暂存及运输温度：2-8℃条件下暂存及运输。3.时效性：样本离体后不超过72h。4.标记：标记清晰、准确完整，可识别。5.样本质量：a)样本要新鲜、无灼烧、无坏死、无固定。b)样本量≥100mg。c)组织无结冰。

单细胞测序项目由项目联系人负责与研究者对接

长三角肺癌协作组

为了推动肺癌规范化诊治及创新研究，2019年12月底，由上海交通大学附属胸科医院、东部战区总医院、浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院等40余家来自江、浙、沪、赣、闽、皖地区的医疗机构，共同成立“长三角肺癌协作组”。上海交通大学附属胸科医院肿瘤科陆舜教授说，临床医学的进步往往离不开创新研究，而在肺癌诊治领域中，依然有很多问题亟待解决，其中就包括对非小细胞肺癌和小细胞肺癌的研究。成立协作组的目的，是通过设计、开展肺癌研究领域的多中心临床试验及转化研究，特殊病例多中心会诊等，为肺癌临床实践提供高级别的循证医学证据，促进长三角地区肺癌的诊疗、转化研究的创新性及前沿性，提高东部地区肺癌的诊治水平和国际影响力。