J Neurosci | 吸入麻醉药物的突触前作用机制

本文由“Anesthesiology神经科学”授权转载

作者 | WYJ

审稿 | zc

2020年5月在J Neurosci发表了题目《Frequency-Dependent Block of Excitatory Neurotransmission by Isoflurane via Dual Presynaptic Mechanisms》的文章，探讨了经典吸入麻醉药物异氟烷（Isoflurane）抑制兴奋性突触传递的作用机制。

研究发现，在大鼠脑干切片的突触，异氟烷能够通过阻断突触前Ca2+通道和递质释放的胞吐机制，抑制兴奋性神经突触传递。其中，对于高频电活动引起的突触传递更加敏感。探讨吸入麻醉药物基本的突触调控对于理解全身麻醉药物的分子和生理机制以及开发更具选择性和安全性的麻醉药物有着至关重要的意义。

在吸入麻醉药物的作用机制研究中，对于突触传递的影响是一个重要方向。已经有大量研究证实，对于兴奋性突触传递，吸入麻醉药物更主要是作用于突触前，也就是影响神经递质的释放。与此相对应，静脉全身麻醉药物例如丙泊酚和依托米脂则主要是通过作用于突触后的GABAA受体。基于已有的大量研究基础背景，J Neurosci这篇文章的主要创新点则是在脑片水平证实了吸入麻醉药物异氟烷对高频电活动引起的突触传递更加敏感，可以发挥一种类似“低频滤波”（low frequency filter）的效应，同时表明抑制兴奋性递质的释放既可以通过降低Ca2+ influx，也可能在高频长时间兴奋时直接通过抑制胞吐作用的“机械”（Exocytosis machinery）机制。

在完整介绍本文之前，我们先复习一下突触传递（这里指的是化学突触）的胞吐作用过程以及吸入麻醉药物的突触前作用机制基础。

01 突触传递  

图1: 经典的化学突触模型。

化学突触是神经系统信息传递的主要形式。当突触前神经元的兴奋传递到末梢时，突触前膜去极化。当去极化达到一定水平时，突触前膜中的电压门控钙通道开放，产生钙离子内流（Ca2+ influx），胞内钙离子浓度瞬间升高，由此触发突触囊泡释放（Exocytosis），即产生胞吐作用，引起神经递质的量子式释放，然后作用于突触后膜的相应受体。其中，中枢神经系统的主要兴奋性递质为谷氨酸（Glutamate）。递质释放的过程中涉及的离子通道主要包括电压门控的钠通道（Nav）、钾通道和电压门控钙通道 (Cav)。

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02 吸入麻醉药物的突触前作用机制基础

1、吸入麻醉药物能够抑制突触传递中的递质囊泡释放（Exocytosis）

大约20年前，研究就证实了吸入麻醉药物异氟烷能够抑制递质囊泡的释放（图2）。

图2: 通过荧光成像的技术，转染pHluorin蛋白，能够检测到由于递质囊泡释放引起的局部pH变化，进而改变荧光强度。

有意思的是，对比左右两幅图可以发现，异氟烷对于电刺激引起的囊泡释放能够明显抑制，而对高K+直接引起膜去激化导致的囊泡释放没有显著的抑制，这说明对突触前膜动作电位传递的抑制是异氟烷在突触前抑制递质释放的主要机制之一。这其中的靶点就很可能包括了电压门控钠离子通道（Nav）和钙离子通道（Cav）1。

2、吸入麻醉药物对兴奋性递质释放的抑制作用比对抑制性递质释放更加显著

图3: 异氟烷对谷氨酸释放的抑制作用强于对GABA的释放2。

这个结果也许可以在一定程度上解释为什么通过抑制突触传递，异氟烷在整体上趋于抑制？因为异氟烷对兴奋性神经递质的抑制作用更加显著。

3、吸入麻醉药物对神经递质释放的抑制作用在中枢神经系统不同区域具有差异

图4: 异氟烷对Glutamate释放的抑制作用更大，而且在皮层，海马，纹状体以及脊髓等不同部位的抑制效价有所差异3。

这个结果也许可以解释吸入麻醉药物在不同浓度下能够在中枢神经系统产生不同的药理学作用，例如产生意识消失和顺行性遗忘的作用就有不同的敏感性和起效浓度。

4、吸入麻醉药物对神经递质释放的作用机制主要是通过抑制Ca2+ influx，而不是胞内Ca2+与囊泡释放的偶联机制2

Joel P. Baumgart和Zhenyu Zhou等通过动作电位刺激诱发海马神经元胞吐作用，采用荧光定量成像测定vGlut-pHluorin (Vg-pH) 或synapto-pHlourin (syn-pH) 荧光强度变化，详细比较了异氟烷对神经元胞吐作用的影响。同时，通过Ca2+成像（GCaMP3）直接观察了异氟烷对Ca2+ influx的影响。研究发现，临床相关浓度的异氟烷能够直接抑制Ca2+ influx （图5）。

图5: 异氟烷抑制Ca2+ influx。C图的蓝色Bar代表了临床相关浓度，0.5-2 MAC。

与此同时，异氟烷能够抑制Ca2+依赖的神经元胞吐作用（图6）。

图6: 异氟烷抑制Ca2+依赖性的突触囊泡释放。

通过进一步比较异氟烷抑制Ca2+ influx与抑制胞吐作用的相关性，发现异氟烷对突触囊泡释放的抑制与对Ca2+ influx的抑制关系完全一致（图7）。

图7：异氟烷对突触囊泡释放的抑制与对Ca2+ influx的抑制关系完全一致。

因此得出结论异氟烷通过抑制Ca2+ influx从而降低了突触的递质释放，而不是通过Ca2+ influx下游的囊泡释放的Exocytosis machinery。这一点和J Neurosci的《Frequency-Dependent Block of Excitatory Neurotransmission by Isoflurane via Dual Presynaptic Mechanisms》这篇文章有一些不一样，为什么不一样下面会提到。

  03 创新点和意义分析

在介绍了以上这么多吸入麻醉药物的突触前作用机制的研究基础以后，再

回头看《Frequency-Dependent Block of Excitatory Neurotransmission by Isoflurane via Dual Presynaptic Mechanisms》这篇文章，就会对该研究的创新点和意义更加清楚了。

本文以大鼠脑干Calyx of Held（一种谷氨酸能兴奋性突触）作为研究对象。通过使用不同频率的电刺激诱导胞吐作用。研究发现异氟烷能够降低EPSC（兴奋性突触后电流）（图8 A-B），同时对mEPSC没有抑制作用（图8 C-D）。

图8: 临床相关浓度的异氟烷抑制EPSC（A-B），对mEPSC没有抑制作用（C-D）。

这个结果验证了已经知道的一个结论，那就是异氟烷抑制兴奋性突触传递主要是通过抑制突触前递质释放，对突触后的受体影响较小。

接下来，通过改变细胞外液中Ca2+的浓度，发现突触外Ca2+浓度与EPSC大小呈正相关，异氟烷在不同钙离子浓度下都可以对EPSC均有抑制效果，而量效关系呈现量子式变化，说明异氟烷能够通过抑制突触前递质释放靶点来降低递质释放的概率（图9）。

图9: 突触外Ca2+浓度与EPSC大小呈正相关 (A)，异氟烷在不同钙离子浓度下均对EPSC抑制，这种抑制源于异氟烷影响了递质释放位点数量（B）和递质释放的概率（C）。

为了探索递质释放位点数量与递质释放概率抑制的原因，检测了异氟烷对突触前Cav （电压门控钙离子通道）, Kv（电压门控钾离子通道）以及Nav（电压门控钠离子通道）等离子通道的作用。这些离子通道是突触前动作电位产生和传递最关键的几个离子通道（虽然这些离子通道与异氟烷的相互作用已经有大量研究结果）。结果与以前的研究类似，异氟烷对Cav （图10A）, Kv（图10B）以及Nav（图10C）均有显著的抑制。

图10: 异氟烷抑制突触前Cav （A）, Kv（B）以及Nav（C）。通过抑制这些离子通道能够影响突触前动作电位的大小和传递。

然后，本研究发现异氟烷对突触传递的抑制作用具有频率依赖性。同时，在较低频率刺激引起的小量递质释放中，异氟烷主要通过抑制Ca2+ influx，这一点和2015年的《PNAS》2结论一致；然而在高频和长时间刺激引起的大量递质释放时，异氟烷可能主要直接抑制Ca2+ influx下游的囊泡释放的Exocytosis machinery，也是本文的最大创新点（图11）。

图11: 通过电容变化监测囊泡释放，同时与Ca2+浓度的变化做对比（与图7的方法本质上是一样的，图7对于exocytosis采用的荧光成像的方法）可以发现，在较小范围的时候，Ca2+浓度的变化与囊泡释放的变化是一致的；而在更大的囊泡释放时，就不能通过Ca2+浓度的变化来解释了。

因此作者推测这部分的抑制可能直接源于对Exocytosis machinery的作用。为什么和图7的结论有所不同？原因是本文的刺激更大，也就是说只有当高频和长时间刺激引起的大量递质释放时，Exocytosis machinery才会作为异氟烷的作用机制。

图12: 异氟烷对突触传递的抑制作用具有频率依赖性。通过同时记录突触前和突触后，发现异氟烷（1-2 MAC）对高频刺激引起的突触传递具有更大的抑制作用，而对低频电刺激引起的突触传递几乎没有影响。

Tip: 虽然本文没有进一步探讨为什么异氟烷对突触前高频电活动更加敏感，我们通过异氟烷对电压门控离子通道的作用可以猜测，异氟烷能够稳定电压门控离子通道在激活后的失活状态，延长下一次刺激引起开放的时间，因此对于高频电活动来说，同样程度的失活状态延长可能带来更加显著的频率抑制。

最后，本研究在整体动物模型初步验证了脑片的结果（图12）。采用光遗传结合电生理记录，验证了异氟烷对皮层兴奋性突触传递的抑制作用，能够抑制高频刺激引起的突触传递（图13 G-H）。

图13: 异氟烷对皮层兴奋性突触传递的抑制作用，能够显著降低高频刺激引起的突触后动作电位。

综上所述，全身麻醉药物的突触作用机制是其药理作用的主要部分，对于解释全麻药物的不同药理学作用具有重要意义。目前我们已经知道了很多全身麻醉药物突触作用的“现象”，今后研究的主要方向是找到确切的作用靶点来进一步深入解释全身麻醉药物在突触前对兴奋性神经递质具有高敏感性的原因，同时验证这些靶点对于改善全身麻醉药物的效价，降低不良反应是否具有临床转化价值。

P.S. 关于全身麻醉药物的突触作用机制，感兴趣的小伙伴可以查看我们的一篇今年的综述，里面总结了近400篇相关文献：

PMID: 32106800

DOI: 10.2174/1570159X1866620022712585

参考文献：

1. Hugh C. Hemmings, Jr., Wayne Yan, Robert I. Westphalen, and Timothy A. Ryan. The General Anesthetic Isoflurane Depresses Synaptic Vesicle Exocytosis. Mol Pharmacol 2005; 67:1591–1599

2. Joel P. Baumgart, Zhen-Yu Zhou, Masato Hara, Daniel C. Cook, Michael B. Hoppa, Timothy A. Ryan, and Hugh C. Hemmings Jr. Isoflurane inhibits synaptic vesicle exocytosis through

reduced Ca2+ influx, not Ca2+-exocytosis coupling. Proc Natl Acad Sci U S A 2015; 112 (38): 11959-64

3. Robert I. Westphalen, No-Bong Kwak, Keir Daniels，Hugh C. Hemmings Jr. Regional differences in the effects of isoflurane on neurotransmitter release. Neuropharmacology 2011; 61: 699-706 

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