大肠杆菌干扰肠上皮细胞长链脂肪酸摄取机制研究

2020

06/05

上海沃吉基因

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产肠毒素大肠杆菌（ETEC）对FA摄取的影响机制。

文章信息

EnterotoxigenicEscherichia coli Interferes FATP4-Dependent Long-Chain Fatty Acid Uptake ofIntestinal Epithelial Enterocytes via Phosphorylation of ERK1/2-PPARγ Pathway

Zhi Li, Heyuan Liu, Bocheng Xu and Yizhen Wang

DOI:.org/10.3389/fphys.2019.00798

发表杂志：Frontiers in Physiology

1.研究背景

空肠腔摄取足量脂肪酸（FA）与儿童生长密切相关。产肠毒素大肠杆菌（ETEC）对幼年哺乳动物的健康构成了极大的威胁，它也以空肠为靶点，但对FA摄取的影响尚不清楚。

2.方法

2.1Bodipy标记FA摄取测定及荧光共聚焦显微镜。

2.2极化IPEC-J2细胞株FATP4基因敲除实验。

2.3 利用中国Wcgene(上海）生物技术公司的应用生物系统ViiAReal-time-PCR系统进行了实时定量PCR（RT qPCR）检测。

2.4 将蛋白样品灌胃至10%SDS-page电泳分离并进行免疫印迹。

3.结果

3.1ETEC灌胃对断奶仔猪的影响

67221591338744806 图1.ETEC灌胃对断奶仔猪的影响。（A）仔猪血清D-乳酸含量。（B）橄榄油灌胃仔猪血清中FA的气相色谱分析。（C）TJs-claudin-1、claudin、ZO1蛋白的Western blot分析；FA摄取相关蛋白FATP4、CD36；信号通路蛋白ERK1/2、p-ERK1/2、PPARγ、p-PPARγ。

3.2 IPEC-J2细胞系的极化

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图2.IPEC-J2细胞极化促进肠屏障和LCFA摄取能力。（A）跨孔培养IPEC-J2细胞的时间依赖性TER测定。（B）扫描电镜观察第3天和第28天生长的细胞。（C）细胞计数法标记C12:0和C16:0的摄取。（D） TJs-claudin-1、claudin、ZO1、FA摄取相关蛋白FATP4和CD36的Western blot分析。

3.3 ETEC激发对极化IPEC-J2细胞的肠屏障损伤图3.ETEC挑战使极化IPEC-J2细胞系的肠屏障瘫痪。（A） TER测量。（B） TJs claudin-1，occludin和ZO1的RT-qPCR分析；促炎因子IL6和炎性细胞因子TGFβ。（C） TJs claudin-1，occludin，ZO1的Western印迹分析。

3.4 ETEC诱导的极化IPEC-J2细胞系LCFA摄取异常

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图4.ETEC的激发破坏了LCFA的摄取，引起ERK1/2和PPARγ的磷酸化。（A）扫描电镜图。（B）细胞计数法标记C12:0和C16:0的摄取。（C）IPEC-J2细胞中Bodipy标记C12:0和C16:0的共聚焦显微镜观察。（D）连续3.5h培养的MEM+10%FBS（血清）、3.5h培养的纯MEM（血清）、3h饥饿后0.5h培养的MEM+10%FBS（MEM+血清）的细胞内TG积累测定。（E）对照组和ETEC组与MEM+血清处理相同，而ETEC组细胞首先在含MEM的ETEC中培养。（F） FATP4和CD36的RT-qPCR分析。（G） FA摄取相关蛋白FATP4和CD36的Western blot分析；信号通路蛋白ERK1/2、p-ERK1/2、PPARγ、p-PPARγ。 3.5 FATP4在极化IPEC-J2细胞系中摄取LCFA

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图5.FATP4在极化IPEC-J2细胞系的LCFA摄取中是必不可少的。（A）用加扰的siRNA（nc）或si-FATP4（si-FATP4）转染的FATP4的蛋白质印迹分析。（B）通过细胞计数标记的C12:0和C16:0的摄取。（C）用nc，sh-FATP4和ETEC+sh-FATP4转染的FATP4的蛋白质印迹分析。（D）通过细胞计数的C12:0和C16:0的摄取。

3.6ERK1/2-PPARγ充当FATP4的调节途径

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图6.ERK1/2和PPARγ的磷酸化下调了FATP4的表达，从而降低了LCFA的摄取。（A）用U0126（+/-）和ETEC（+/-）处理的ERK1/2，p-ERK1/2，PPARγ，p-PPARγ和FATP4的蛋白质印迹分析。（B）通过细胞计数标准化Bodipy标记的C12:0和C16:0的摄取。（C）用T0070907（+/-）处理的ERK1/2，p-ERK1/2，PPARγ，p-PPARγ和FATP4的蛋白质印迹分析。（D）通过细胞计数标准化Bodipy标记的C12:0和C16:0的摄取。结论总之，断奶仔猪和IPEC-J2细胞系的体内和体外结果表明，ETEC攻击将导致小肠中FATP4依赖性LCFA摄取功能障碍。ETEC可以磷酸化ERK1/2，从而将PPARγ（活化的）转运到p-PPARγ（失活的）中，从而下调FATP4的表达以及LCFA的摄取。