大肠杆菌干扰肠上皮细胞长链脂肪酸摄取机制研究

2020
06/05

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上海沃吉基因
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产肠毒素大肠杆菌(ETEC)对FA摄取的影响机制。

文章信息

EnterotoxigenicEscherichia coli Interferes FATP4-Dependent Long-Chain Fatty Acid Uptake ofIntestinal Epithelial Enterocytes via Phosphorylation of ERK1/2-PPARγ Pathway

Zhi Li, Heyuan Liu, Bocheng Xu and Yizhen Wang 

DOI:.org/10.3389/fphys.2019.00798

发表杂志:Frontiers in Physiology 

1.研究背景

空肠腔摄取足量脂肪酸(FA)与儿童生长密切相关。产肠毒素大肠杆菌(ETEC)对幼年哺乳动物的健康构成了极大的威胁,它也以空肠为靶点,但对FA摄取的影响尚不清楚。

 2.方法

2.1Bodipy标记FA摄取测定及荧光共聚焦显微镜。

2.2极化IPEC-J2细胞株FATP4基因敲除实验。

2.3 利用中国Wcgene(上海)生物技术公司的应用生物系统ViiAReal-time-PCR系统进行了实时定量PCR(RT qPCR)检测。

2.4 将蛋白样品灌胃至10%SDS-page电泳分离并进行免疫印迹。

3.结果

3.1ETEC灌胃对断奶仔猪的影响

67221591338744806图1.ETEC灌胃对断奶仔猪的影响。(A)仔猪血清D-乳酸含量。(B)橄榄油灌胃仔猪血清中FA的气相色谱分析。(C)TJs-claudin-1、claudin、ZO1蛋白的Western blot分析;FA摄取相关蛋白FATP4、CD36;信号通路蛋白ERK1/2、p-ERK1/2、PPARγ、p-PPARγ。

 3.2 IPEC-J2细胞系的极化 

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图2.IPEC-J2细胞极化促进肠屏障和LCFA摄取能力。(A)跨孔培养IPEC-J2细胞的时间依赖性TER测定。(B)扫描电镜观察第3天和第28天生长的细胞。(C)细胞计数法标记C12:0和C16:0的摄取。(D) TJs-claudin-1、claudin、ZO1、FA摄取相关蛋白FATP4和CD36的Western blot分析。

 3.3 ETEC激发对极化IPEC-J2细胞的肠屏障损伤93741591338745052图3.ETEC挑战使极化IPEC-J2细胞系的肠屏障瘫痪。(A) TER测量。(B) TJs claudin-1,occludin和ZO1的RT-qPCR分析;促炎因子IL6和炎性细胞因子TGFβ。(C) TJs claudin-1,occludin,ZO1的Western印迹分析。

 3.4 ETEC诱导的极化IPEC-J2细胞系LCFA摄取异常

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图4.ETEC的激发破坏了LCFA的摄取,引起ERK1/2和PPARγ的磷酸化。(A)扫描电镜图。(B)细胞计数法标记C12:0和C16:0的摄取。(C)IPEC-J2细胞中Bodipy标记C12:0和C16:0的共聚焦显微镜观察。(D)连续3.5h培养的MEM+10%FBS(血清)、3.5h培养的纯MEM(血清)、3h饥饿后0.5h培养的MEM+10%FBS(MEM+血清)的细胞内TG积累测定。(E)对照组和ETEC组与MEM+血清处理相同,而ETEC组细胞首先在含MEM的ETEC中培养。(F) FATP4和CD36的RT-qPCR分析。(G) FA摄取相关蛋白FATP4和CD36的Western blot分析;信号通路蛋白ERK1/2、p-ERK1/2、PPARγ、p-PPARγ。 3.5 FATP4在极化IPEC-J2细胞系中摄取LCFA 

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图5.FATP4在极化IPEC-J2细胞系的LCFA摄取中是必不可少的。(A)用加扰的siRNA(nc)或si-FATP4(si-FATP4)转染的FATP4的蛋白质印迹分析。(B)通过细胞计数标记的C12:0和C16:0的摄取。(C)用nc,sh-FATP4和ETEC+sh-FATP4转染的FATP4的蛋白质印迹分析。(D)通过细胞计数的C12:0和C16:0的摄取。 

3.6ERK1/2-PPARγ充当FATP4的调节途径

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图6.ERK1/2和PPARγ的磷酸化下调了FATP4的表达,从而降低了LCFA的摄取。(A)用U0126(+/-)和ETEC(+/-)处理的ERK1/2,p-ERK1/2,PPARγ,p-PPARγ和FATP4的蛋白质印迹分析。(B)通过细胞计数标准化Bodipy标记的C12:0和C16:0的摄取。(C)用T0070907(+/-)处理的ERK1/2,p-ERK1/2,PPARγ,p-PPARγ和FATP4的蛋白质印迹分析。(D)通过细胞计数标准化Bodipy标记的C12:0和C16:0的摄取。  结论总之,断奶仔猪和IPEC-J2细胞系的体内和体外结果表明,ETEC攻击将导致小肠中FATP4依赖性LCFA摄取功能障碍。ETEC可以磷酸化ERK1/2,从而将PPARγ(活化的)转运到p-PPARγ(失活的)中,从而下调FATP4的表达以及LCFA的摄取。

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关键词:
大肠杆菌,机制,细胞

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