FFPE切片还是ctDNA?靶向药基因检测取样可不简单(上)

2020
04/21

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承启医学
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新鲜癌组织取到后必须快速进行冷藏和运输,否则降解速度会很快。

老刘是一名年过六旬的烟民,前不久刚被诊断出肺腺癌。医生根据国内外治疗指南的要求,建议他去做个基因检测,看有没有合适的靶向药。

随行的老伴一听靶向药就有些激动,老刘倒是淡定得多。几个月前,他看到一篇很详尽的科普文,知道癌症是十分复杂的,靶向药并非人人可用,某些癌症的化疗+靶向等综合治疗方案会明显优于纯靶向治疗。当然,如果真有合适的靶向药,那确实是锦上添花,医生也建议了,老刘决定试一试。

基因检测也不是啥新鲜事儿了,没想到检测第一步——取样,就困难重重。

那天老刘被女儿领着正要去医院预约切除手术,顺便也预约测序样本,就是那个FFPE切片。路上偶遇女儿的高中同学孙先生,人家现在可是一名海龟博士,还正好是分子生物学相关领域的。这不,聊到老刘要去拿FFPE切片做靶向药基因检测,孙先生立马开启了科普模式。

“ 要说检测样本,其实FFPE切片并非最佳选择,甚至有几个不容忽视的误判风险。”

1.DNA发生化学损伤,导致测序的错误率升高

FFPE是福尔马林固定石蜡包埋的简称。在制作过程中,会对DNA造成较严重的化学损伤,例如某些碱基的基团发生了化学反应,会使得测序错误率升高。还容易导致DNA发生断裂和重排,产生“嵌合序列”(chimeric reads) [1],这让最终得到的体细胞突变信息就变得不那么准确了。测序错误率升高会导致碱基误判,“嵌合序列”则会导致重排基因误判,两者都可能把本来不适用于你的靶向药推荐给你,你吃了之后好久才发现没用,花冤枉钱事小,延误治疗可就事大了。

2.保存条件参差不齐,造成DNA进一步降解或氧化

一般医院使用FFPE切片是为了做IHC(免疫组化)以做病例确诊和病理分型,因此其操作和保存条件通常只考虑IHC的需求,即着重于保证蛋白质在一定时间内不降解。但测靶向药需检测核酸,核酸的稳定性不如蛋白质,在保证蛋白质不降解的条件下难以确保核酸也不降解。DNA可能因保存条件不合适而遭到进一步降解或氧化,造成噪声升高,干扰体细胞突变的判定。

3.DNA提取量降低,导致测序偏好性升高

偏好性是指基因组中某些区段的扩增效率高于另一些区段,从而造成某些区段较容易被测到,另一些区段较难被测到(这与DNA的碱基序列有关,现有技术无法从根本上解决)。而从FFPE中提取DNA,效率比从新鲜组织中提取低得多,甚至能低一个数量级,从而造成DNA提取量低。这时就会使用一些实验手段来弥补,例如扩增循环数增加,也能检测,但导致了偏好性上升。偏好性越厉害,可能会使某些较难被测到的关键位点没被有效测到,或测到的次数过少而难以可靠判定突变。

4.使用FFPE白片片数较多时,癌细胞占比会发生偏移

癌组织块中含有一定量的正常细胞,为了尽可能排除正常细胞的基因组信息干扰,数学模型需知晓大致的癌细胞比例,例如50%或60%,才能精确计算癌细胞的突变。为了获得癌细胞比例,通常需要选取1-2张白片做染色参照。但由于FFPE切片DNA提取效率较低,往往需要7-15片才能提取到足够量。每片切片厚度10-20微米,大致相当于0.5-1层细胞的厚度。取7-15片时,已远离了作为参照的那张切片,可能导致癌细胞占比与参照切片不一致,从而导致计算误差。

“那什么样本最可靠?”老刘赶紧问道。

“ 为了尽可能保证数据的质量和结果的可靠性,如果条件允许,测癌组织时要尽量取到新鲜癌组织。”

“既然如此,为何多数癌友还是拿的FFPE切片去做测序呢?”老刘不禁纳闷。

“在医学院里,医生们普遍只有制作FFPE并进行IHC染色病理检查的流程训练。为了减少创伤,穿刺需尽可能少做,而穿刺出来的癌组织体积很小,需优先供IHC染色病理检查确诊使用,加上多数医院不具备将如此小体积的组织块再进行精密切割的技术能力,就很难将穿刺出来的新鲜癌组织分出一半给病人用于测序,而是一起做成了FFPE切片。

同时,FFPE切片保存起来要比新鲜组织容易得多,体积小、保存条件要求低,所以比起新鲜癌组织,提供FFPE白片对医院来说容易得多。”孙先生再次解释到。

老刘正要说点什么,孙先生接着说:“其实还是可以和医生商量的。”

“如果是打算穿刺,可与医生商量,看医院是否具备条件对穿刺样本进行切割,以同时满足IHC染色病理检查和新鲜样本测序的需求;如果要做手术切除,也可以事先和医生沟通好,将手术切除的癌组织保留下来。一般能手术切除的肿瘤组织都比较大,直径至少几个厘米,容易切割。

但无论是哪种情况,新鲜癌组织取到后必须快速进行冷藏和运输,否则降解速度会很快。所以需要有人提着冰盒甚至液氮罐,在手术准备室等候随时待命。如何正确摆放和运送样品也需要专业知识。中国病人多医生少,医院通常很难安排具备专业知识的人员专门这么等着,这也是医院难以提供新鲜组织样本的原因之一。”

“这也太麻烦了吧!不如去做液体活检(ctDNA)得了。”老刘插嘴道。

孙先生连连摆手:

“ ctDNA并不能替代组织活检。不仅价格高昂,其准确度也还很不理想。能取到组织样的,通常都是优先测组织样,哪怕FFPE都比ctDNA靠谱。”

近来大火的ctDNA为何不被推荐?老刘能顺利做完靶向药检测吗?更多老刘的治疗分享,请关注承启医学,下回接着聊。

参考文献

[1] Haile, S., et al., Sources of erroneous sequences and artifact chimeric reads in next generation sequencing of genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded samples. Nucleic Acids Res, 2019. 47(2): p. e12.

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