黑科技实现单个神经元进行“开或关”

要了解基因在不同大脑结构中的功能，就需要高时空精度来操纵基因表达。此外，大脑中神经环路的研究越来越受到广泛关注，特别是针对某一种类型的神经元。

大脑中神经环路是复杂的，是由大量具有分子、解剖和生理特性不同的相互连接的神经元组成。 标记特定类型神经元并研究其功能的最有效方法依赖于遗传学。

使用重组酶的转基因或病毒表达可进行特定的基因修饰，也可以通过降低病毒剂量来实现稀疏的神经元标记。但是用这些方法实现的遗传修饰是随机的，并且难以定向到特定的目标细胞。 目前已有研究光诱导cre酶表达后调控基因的表达，这主要是依赖于新出现的光诱导位点特异性DNA重组酶技术。Cre重组酶可催化DNA重组酶loxP位点之间的位点，通常用于打开或关闭基因表达。

2020年3月23日美国艾伦脑科学研究所AliCetin团队在Nature Methods杂志上发表文章开发了新型光诱导Cre酶系统，可在单细胞水平上靶向进行基因修饰。

研究人员将Cre酶的N末端片段融合到VVD单体（光敏真菌蛋白被用于光诱导的cre酶系统）的N端，Cre的C末端到另一个VVD单体的C末端，这样在光激活下Cre酶的N末端和C末端发生结合后被激活，这种重组蛋白称为CreV。基于这个原理，他们又将其进行拓展，将cre酶位点替换成Dre酶位点，形成DreV蛋白，这个系统称为RecV系统。 与此同时，研究人员也对Flp重组酶进行筛选，选择高效率的Flp重组酶，以便于更好的进行交叉基因组修饰。采用这个系统，光激活5min基因修饰后开始起效，1小时后达到高峰。

RecV系统有什么优点呢？首先体现在标记的整体性和特异性上：通过向Dre小鼠的尾静脉注射可跨血脑屏障的AAV-PHP.eB-Syn-NDreV（含有DreV蛋白质粒的病毒）在单光子或双光子激活下可实现全脑神经元的标记。除了能够实现全脑的光激活基因修饰，也可以对特定类型的神经元实现。

其次表现在物种上，这种RecV系统不仅可以小鼠中使用，比如斑马鱼。再次表现在组织类型上，这种RecV系统不仅仅很好的表达在神经元上，在心脏、皮肤、肌肉等外周组织中也能够表达。

最重要一点就是，与目前通过他莫昔芬等药物诱导的基因调控技术相比，RecV系统具有很好的时空分辨率，通俗一些来说就是你想在什么时候、在什么脑区标记什么类型的神经元都是可以的，打破了时间界限。

 此外，RecV系统也很良心了，居然可以实现稀疏标记，满足对于形态学分析的需求。他们将含NCreV的病毒注射到Ai139小鼠中，进行稀疏但强烈的荧光表达，通过与华中科技大学骆清铭院士（现为海南大学校长）合作，利用fMOST技术，对这些标记的神经元进行全脑轴突投射重构。

目前很少能够在单细胞水平进行基因调控的。研究人员利用这套RecV系统进行单细胞的精准调控，具体是怎么是实现的呢？他们向Ai-14小鼠的初级视觉皮层中注射rAAV -iCreV 和rAAV- tdTomato 的混合病毒，第一阶段对单个表达绿色荧光的神经元进行双光子激活，可以看到仅仅该神经元表达tdTomato；第二阶段对该区域大部分的神经元进行光激活，可以看到大部分神经元表达tdTomato

这就表明可以通过双光子激活实现单个神经元精准调控。同时，RecV系统可与钙指示剂联用，实现神经元功能成像。 即使目前全球最精准的战略导弹也存在一定的误差，那么RecV系统的误差是多大?由于双光子的激光能量较大（对于单个细胞而言）,因此会诱导周围的神经元表达荧光，具体来说，靶细胞10 µm半径内可引起18%神经元的非特异性表达，靶细胞半径10–50 µm内这一比例为6–7％。