使用PCR array分析多不饱和脂肪酸对胎儿发育的影响

文章标题：

Analysis of the effects of polyunsaturated fatty acids on transporter expressions using a PCR array: Induction of xCT/SLC7A11 in human placental BeWo cells

Kanako Ono，Ayako Furugen，Yuko Kurosawa，Naoko Jinno，Katsuya Narumi，Masaki Kobayashi，Ken Iseki

杂志：Placenta

DOI：doi.org/10.1016/j.placenta.2018.11.010

研究背景：

多不饱和脂肪酸（PUFA），包括花生四烯酸（AA），二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），对于胎儿生长至关重要。本研究的目的是阐明PUFA对胎盘转运蛋白表达和功能的影响，胎盘转运蛋白在胎盘功能中起重要作用，包括胎儿的营养供应，代谢物的排泄以及异生素对胎儿的保护。

方法

人胎盘绒毛膜癌BeWo细胞用作滋养层细胞模型。通过PCRarray研究了PUFA诱导的84种转运蛋白的基因表达变化。分别通过蛋白质印迹和摄取实验评估蛋白质水平和转运蛋白的活性。用怀孕的Wistar大鼠分析胎盘的转运蛋白表达。

结果

1.PUFAs对BeWo细胞活力和脂肪分化相关蛋白表达的影响

用MTT评估PUFA处理后的细胞活力。用AA，EPA或 DHA处理24小时不影响BeWo细胞的存活率（图1A）。我们的实验证实了PUFA对ADRP mRNA表达的影响：AA，EPA和DHA诱导ADRP mRNA的表达分别达到对照值的191％，169％和174％（图1B）。

图1.用PUFA处理后的细胞活力（A）和ADRP mRNA表达（B）。用100μM的AA，EPA或DHA处理BeWo细胞24小时。

2.PCR数组分析PUFA对转运蛋白表达的影响

在本研究中，通过PCRarray评估BeWo细胞中84种转运蛋白基因的表达水平。未经PUFA处理（对照）的BeWo细胞的Ct值分布如图2A所示。在BeWo细胞中检测到PCRarray中大约70％的转运蛋白基因。20％的基因高度表达，28％是中间的，23％的基因表现出低表达水平。图2B和C显示对照样品中每种基因的表达水平与AA处理的（B）或EPA处理的（C）样品的散点图。AA和EPA显着增加SLC7A11表达。

图2.AA和EPA对转运蛋白表达影响的PCRarray分析。（A）BeWo细胞（对照样品）的Ct值的分布。（B和C）BeWo细胞用100μM AA或EPA处理24小时。散点图描绘了对照中每种基因相对于测试样品AA（B）或EPA（C）的表达水平。

3.PUFA对xCT / SLC7A11表达和功能的改变

随后，通过RT-qPCR验证BeWo细胞中PUFA的SLC7A11 mRNA的变化。通过AA和EPA诱导SLC7A11的表达水平分别达到对照值的414％和636％（图3A）。此外，用DHA处理还使SLC7A11增加至BeWo细胞中对照值的294％。 SLC7A11编码胱氨酸/谷氨酸转运蛋白xCT蛋白。蛋白质印迹分析显示PUFA（AA，EPA和DHA）分别使xCT蛋白水平增加至对照的209％，222％和219％（图3B）。xCT / SLC7A11 Na + - 独立地介导胱氨酸对细胞的摄取与谷氨酸的外排相结合。在无Na +条件下通过[14 C] -胱氨酸转运活性评估xCT / SLC7A11的功能。根据xCT蛋白质水平的诱导，AA，EPA和DHA分别将对BeWo细胞的[14 C] -胱氨酸摄取显着增加至对照的180％，209％和250％（图3C）。

图3.多不饱和脂肪酸对xCT / SLC7A11表达和功能的影响。（A）用100μM的AA，EPA或DHA处理BeWo细胞24小时。处理后，通过RT-qPCR研究xCT / SLC7A11的表达。（B）用PUFA处理的BeWo细胞的Western印迹。（C）用PUFA处理后，研究了[14 C] - 胱氨酸的摄取活性。将BeWo细胞与含有[14 C] - 胱氨酸的无Na +转运缓冲液一起温育10分钟。

4.敲低NRF2 / NFE2L2不影响PUFA对xCT / SLC7A11的改变

使用siRNA研究了NRF2参与BeFA细胞中PUFA对xCT / SLC7A11的改变。靶向NRF2 / NFE2L2的siRNA处理72小时显着降低NRF2mRNA表达至阴性对照水平的约20％（图4A）。血红素加氧酶-1（HO-1 / HMOX1）是NRF2的另一个靶基因，在阴性对照siRNA条件下由PUFA（尤其是AA和DHA）诱导（图4B）。NRF2 siRNA处理减弱了这些PUFA对HO-1的诱导。相反，NRF2 siRNA处理不会减弱PUFA（AA和EPA）对xCT / SLC7A11的诱导（图4C）。

图4. NRF2 siRNA敲除对PUFA Xct/SLC7a 11变化的影响。用阴性对照siRNA或NRF 2/nf2 L2 SiRNA(hs s 107130)转染BeWo细胞，然后用PUFAs (AA、EPA或DHA)处理24?h(a)NRF 2/nf2 L2，(B) HO-1/HMOX1，和(C) xCT/SLC7A11 mRNA通过RT-qPCR评估BeWo细胞的表达。

5. xCT / Slc7a11在大鼠胎盘中的表达

据报道，xCT在各种癌细胞和组织中过表达。因此，我们通过RT-PCR研究了正常大鼠胎盘中的xCT / Slc7a11表达。在GD12和GD20的大鼠胎盘中检测到xCT / Slc7a11（图5）。此外，数据表明GD 20的xCT表达低于GD 12。

图5.大鼠胎盘GD12和GD20的RT-PCR分析。β-肌动蛋白用作上样对照。

结果总结

PUFA（AA，EPA和DHA）增加胱氨酸/谷氨酸转运蛋白基因xCT / SLC7A11，其介导细胞摄取胱氨酸以及BeWo细胞中谷氨酸的外流。这些PUFA还增加BeWo细胞中的[14 C] - 胱氨酸摄取。

PUFA诱导的xCT / SLC7A11 mRNA表达未被NRF2敲低阻断。逆转录（RT）-PCR分析表明，在大鼠胎盘中检测到xCT / Slc7a11 mRNA，妊娠期（GD）12的表达水平高于GD 20。

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